Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Василиадис Р.А. 1 Бельская Н.А. 1 Вайнер Г.Б. 1 Денисова С.Г. 1 Бородулин В.Б. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России

В результате проведенного исследования обнаружены изменения активности, скорости ферментативной реакции и величины константы Михаэлиса для ферментов амилазы, щелочной фосфатазы (ЩФ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) ротовой жидкости у больных с пародонтитом различной степени тяжести. В исследованиях in vitro установлено снижение активности амилазы на фоне увеличения активности ферментов ЛДГ и ЩФ. Для диагностики степени воспалительного процесса предложено использовать соотношение активности, скорости ферментативной реакции и изменение величины константы Михаэлиса для ферментов ЛДГ/амилаза и ЩФ/амилаза. Соотношение ЛДГ/амилаза увеличивалось прямо пропорционально степени повреждения пародонта. Показатель ЩФ/амилаза также возрастал при сравнении результатов, полученных при интактном пародонте с результатами, наблюдаемыми при пародонтитах первой, второй и третьей степеней тяжести.

Статья в формате PDF

425 KB

пародонтит

ротовая жидкость

амилаза

щелочная фосфатаза

лактатдегидрогеназа

1. Болезни пародонта. Патогенез, диагностика, лечение / А.С. Григорьян, А.И. Грудянов, Н.А. Рабухина, О.А. Фролова. – М.: Медицинское информационное агенство, 2004. – 320.: ил.

2. Современные аспекты клинической пародонтологии / под ред. Л.А. Дмитриевой. – М.: МЕДпресс, 2001. – 128 с.

3. Дунязина Т.М., Калинина Н.М., Никифорова И.Д. Современные методы диагностики заболеваний пародонта / Т.М. Дунязина, Н.М. Калинина, И.Д. Никифорова. – СПб. институт стоматологии, 2001. – 47 с.

4. Житков М.Ю., Леонтьев В.К. Возможные механизмы иммобилизации щелочной фосфатазы и α – амилазы на эмали зубов / М.Ю. Житков, В.К. Леонтьев // Стоматология. – 1997. – № 6. – С. 9–12.

5. Гильминов Э.М. Стоматологический и соматический статус организма в показателях метаболизма ротовой полости: автореф. дис. … д-ра мед.наук. – Самара, 2002. – 45 с.

6. Григорьев И.В., Николаева Л.В., Артамонов И.Д. Белковый состав слюны человека на фоне различных психоэмоциональных состояний / И.В. Григорьев, Л.В. Николаева, И.Д. Артамонов // Биохимия. – 2003. – Т. 68, № 4. – С. 501–503.

7. Кунин А.А., Ипполитов Ю.А., Лепехина Л.И., Быков Э.Г. Клиническая гистохимия барьерной функции слизистой оболочки десны при пародонтите / А.А. Кунин, Ю.А. Ипполитов, Л.И. Лепехина, Э.Г. Быков // Стоматология. – 2001. – № 80 (1). – С. 13–16.

8. Лебедев К.А., Максимовский Ю.М., Митронин А.В., Понякина И.Д.. Новое понимание патогенеза болезней пародонта в свете работ о роли образраспознающих рецепторов. Аналитический обзор литературы / К.А. Лебедев, Ю.М. Максимовский, А.В. Митронин, И.Д. Понякина // Стоматология для всех. – 2006. – № 2. – С. 24–29.

Распространенность воспалительных заболеваний пародонта среди взрослого и детского населения Российской Федерации остается довольно высокой, несмотря на большое количество научных исследований и методов лечения [1, 2]. Одним из ведущих факторов в этиологии и патогенезе заболеваний пародонта является микробная флора полости рта. Согласно современным представлениям, бактериальная агрессия, являясь одним из инициальных факторов в развитии заболеваний пародонта, вызывает различные формы поражения пародонтального комплекса [3–5]. Полученные данные о роли анаэробной и смешанной бактериальной флоры в развитии заболеваний пародонта позволили выделить группу так называемых пародонтопатогенных бактерий. Ротовая жидкость содержит в своем составе различные биологически активные соединения – ферменты, пептиды, метаболиты, гормоны, иммуноглобулины [6–8]. Изменение состава ротовой жидкости происходит при развитии кариозного процесса, а также при гингивите и различных формах пародонтита, что сопровождается в свою очередь изменением активности ферментов ротовой жидкости. Оценка подобной активности с использованием биохимических методов поможет более точно оценить степень поражения пародонта и более полно мониторировать процесс лечения.

Материалы и методы исследования

Клинические методы исследования

Клинические данные регистрировали в разработанные нами формализованные истории болезни. При клиническом осмотре отмечали зубную формулу, состояние слизистой оболочки полости рта, наличие некариозных поражений, мягкий зубной налет, над- и поддесневые зубные отложения, наличие или отсутствие аномалий зубов и прикуса.

Для объективной оценки гигиенического состояния полости рта и тканей пародонта в процессе наблюдения использовали следующий тест, пародонтальный индекс (ПИ).

Индекс ПИ необходим для выявления степени выраженности воспалительно-деструктивных изменений в тканях пародонта. Оценивают состояние пародонта у каждого зуба: 0 – нет воспаления, 1 – легкий гингивит, воспаление не окружает весь зуб, 2 – гингивит, воспаление полностью окружает зуб, но повреждения прикрепленного эпителия нет, 6 – гингивит с образованием патологического зубо-десневого кармана, прикрепленный эпителий поврежден, жевательная функция зуба не нарушена, зуб неподвижен, 8 – выраженная деструкция тканей пародонта с потерей жевательной функции, зуб легко подвижен, может быть смещен.

Интерпретация индекса: 0,1–1,5 – начальная, I стадия пародонтита, 1,5–4,0 – II стадия, 4,0–8,0 – III стадия.

Определение активности ферментов в ротовой жидкости: щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы и a-амилазы

Объектом исследования являлась нестимулированная ротовая жидкость, полученная путем сплевывания. Собранная ротовая жидкость в количестве 2 мл использовалась для определения активности и кинетических параметров ферментов – лактатдегидрогеназы (ЛДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и амилазы.

В работе использовали набор жидких реагентов, готовых к определению активности щелочной фосфатазы, ЛДГ и a-амилазы в ротовой жидкости. Производитель ЗАО «Диакон».

Данная часть исследования проводилась с помощью готового набора химических реагентов и биохимического анализатора «Hospitex», Швейцария. Для получения разведений образцов ротовой жидкости использовали бидистиллированную воду.

Щелочную фосфатазу определяли по методу W. Kubler, 1973. Щелочная фосфатаза катализирует реакцию гидролиза нитрофенилфосфата с образованием эквимолярного количества нитрофенола и фосфата. Скорость образования нитрофенола прямо пропорциональна активности щелочной фосфатазы и измеряется фотометрически при длине волны 405 нм.

Амилазу определяли по методу В.А. Ткачук и соавт., 2002. Использовали колориметрический ферментативный анализ. Субстратом является 4,6-этилен-нитрофенил-мальтогептозид. Метод основан на полной переработке всех нитрофенилолигомальтозидов – продуктов амилазной активности Анализ дает суммарную амилазную активность (все изоферменты).

Активность лактатдегидрогеназы определяли по методу D. Weissar, 1975. Принципом определения активности лактатдегидрогеназы является ультрафиолетовый метод. Пируват превращается в лактат с одновременным окислением НАДН. Скорость уменьшения экстинкции при 340 нм, связанная с окислением НАДН, прямо пропорциональна активности ЛДГ в пробе.

Определение скорости и константы Михаэлиса – Ментен ферментативной реакции

Скорость реакции определяется как количество вещества, превращенного (образовавшегося или распавшегося) в единицу времени. Она является функцией концентраций участвующих в реакции веществ, которые непрерывно меняются по мере протекания реакции. Поэтому однозначное определение скорости реакции может быть дано только в случае если конечное изменение количества вещества в единицу времени заменить на дифференциальную разность, относящуюся к бесконечно малому времени dt. Количество превращенных веществ обычно выражают в виде изменения объемной концентрации с.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенного исследования обнаружены изменения активности ферментов (амилаза, ЩФ, ЛДГ) ротовой жидкости у пациентов с пародонтитом различной степени, в исследованиях in vitro установлено снижение активности амилазы на фоне увеличения активности ферментов ЛДГ и ЩФ (табл. 1, рис. 1).

При разработке прогностического коэффициента активности ЛДГ/амилаза и оценке его значения для диагностики пародонтита на различных его стадиях следует обратить внимание на то, что концентрация ионов водорода будет находиться в прямой зависимости от активности ЛДГ (в процессе метаболизма глюкозы происходит увеличение концентрации лактата в ротовой жидкости), в то время как активность амилазы слюны будет находиться в обратной зависимости от концентрации ионов водорода и снижается при уменьшении значений рН меньше 6,8. Анализ проведенных исследований показал, что в контроле (при интактном пародонте) данный показатель составляет 2,83 безразмерных единиц, на 1 стадии пародонтита индекс составил 3,30 безразмерных единиц, на 2 стадии пародонтита – 4,85 и на 3 стадии пародонтита 6,10 безразмерных единиц активности. Увеличение индекса активности ЛДГ/амилаза для пародонтита 3 степени по сравнению с показателем интактного пародонта происходит в 2,2 раза.

Кроме показателя ЛДГ/амилаза можно использовать и показатель ЩФ/амилаза, так как активность ЩФ будет в большей степени определяться количеством бактериальных клеток в ротовой жидкости и, следовательно, процессы закисления среды также будут обратно пропорционально коррелировать с активностью амилазы слюны. Анализ проведенных исследований показал, что в контроле (при интактном пародонте) данный показатель составляет 0,32 безразмерных единиц, на 1 стадии пародонтита индекс составил 0,38 безразмерных единиц, на 2 стадии пародонтита – 0,52 и на 3 стадии пародонтита – 0,66 безразмерных единиц активности.

Увеличение индекса активности ЩФ/амилаза для пародонтита 3 степени по сравнению с показателем интактного пародонта происходит в 2 раза.

Таблица 1

Изменение активности ферментов ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом и при пародонтитах различной степени тяжести (in vitro) (ЕД/л)

Примечание. * – достоверность при сравнении активности ферментов ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом в сравнении с активностью ферментов при пародонтитах различной степени тяжести р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Рис. 1. Изменение активности ферментов ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом в сравнении с активностью ферментов при пародонтитах различной степени тяжести (in vitro)

Таким образом, для диагностики степени воспалительного процесса можно использовать соотношение активности ферментов ЛДГ и амилазы, а также ЩФ и амилазы.

Анализ проведенных исследований показал, что в контроле (при интактном пародонте) показатель скорости биохимической реакции для индекса ЛДГ/амилаза составляет 2,2 безразмерных единиц, на 1 стадии пародонтита индекс составил 3,40 безразмерных единиц, на 2 стадии пародонтита – 5,3 и на 3 стадии пародонтита 7,0 безразмерных единиц активности. Увеличение индекса скорости биохимической реакции ЛДГ\амилаза для пародонтита 3 степени по сравнению с показателем интактного пародонта происходит в 3 раза.

Кроме показателя ЛДГ\амилаза можно использовать и показатель ЩФ/амилаза, так как активность ЩФ будет в большей степени определяться количеством бактериальных клеток в ротовой жидкости и, следовательно, процессы закисления среды также будут обратно пропорционально коррелировать с активностью амилазы слюны. Анализ проведенных исследований показал, что в контроле (при интактном пародонте) данный показатель составляет 1,3 безразмерных единиц, на 1 стадии пародонтита индекс составил 2,7 безразмерных единиц, на 2 стадии пародонтита – 4,0 и на 3 стадии пародонтита 5,0 безразмерных единиц активности.

Увеличение индекса скорости биохимической реакции ЩФ\амилаза для пародонтита 3 степени по сравнению с показателем интактного пародонта происходит в 4 раза.

Таким образом, для диагностики степени воспалительного процесса можно использовать соотношение скоростей реакций ферментов ЛДГ и амилазы, а также ЩФ и амилазы.

Таблица 2

Изменение скорости биохимической реакции ферментов ротовой жидкости с интактным пародонтом и пародонтитом различной степени тяжести in vitro (М/л∙с)

Примечание. * – достоверность при сравнении скорости реакции ферментов ротовой жидкости у больных с кариесом р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Рис. 2. Изменение скорости биохимической реакции ферментов ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом в сравнении со скоростью ферментов при пародонтитах различной степени тяжести (in vitro)

Проведенные исследования показали, что в контроле (при интактном пародонте) показатель – константа Михаэлиса – составляет 0,24 безразмерных единиц, на 1 стадии пародонтита индекс составил 0,30 безразмерных единиц, на 2 стадии пародонтита – 0,40 и на 3 стадии пародонтита 0,43 безразмерных единиц активности. Увеличение индекса для константы Михаэлиса ЛДГ/амилаза для пародонтита 3 степени по сравнению с показателем интактного пародонта происходит в 2 раза.

Кроме показателя ЛДГ\амилаза можно использовать и показатель ЩФ/амилаза, так как активность ЩФ будет в большей степени определяться количеством бактериальных клеток в ротовой жидкости и, следовательно, процессы закисления среды также будут обратно пропорционально коррелировать с активностью амилазы слюны. Анализ проведенных исследований показал, что в контроле (при интактном пародонте) данный показатель составляет 0,46 безразмерных единиц, на 1 стадии пародонтита индекс составил 0,52 безразмерных единиц, на 2 стадии пародонтита – 0,72 и на 3 стадии пародонтита 0,88 безразмерных единиц активности.

Увеличение индекса для константы Михаэлиса ЩФ/амилаза для пародонтита 3 степени по сравнению с показателем интактного пародонта происходит примерно в 2 раза.

Таблица 3

Изменение константы Михаэлиса (Km) ферментов ротовой жидкости с интактным пародонтом и у больных пародонтитом с различной степенью тяжести in vitro (⋅10–3 М)

Примечание. * – достоверность при сравнении скорости реакции ферментов ротовой жидкости у больных с кариесом р > 0,05; * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Рис. 3. Изменение константы Михаэлиса ферментов ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом в сравнении с константой Михаэлиса ферментов при пародонтитах различной степени тяжести (in vitro)

Заключение

В исследованиях in vitro установлено снижение активности амилазы на фоне увеличения активности ферментов ЛДГ и ЩФ. Для диагностики степени воспалительного процесса предложено использовать соотношение активности, скорости ферментативной реакции и изменение величины константы Михаэлиса для ферментов ЛДГ\амилаза и ЩФ\амилаза. Использование индексов ферментов в диагностике стадий пародонтита позволит более точно прогнозировать развитие патологического процесса в пародонте и назначить своевременное лечение этого заболевания.

Рецензенты:

Гладилин Г.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики ФПК и ППС, ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Саратов;

Коршунов Г.В., д.м.н., профессор, главный научный сотрудник отдела фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований ГБУ «СарНИИТО» Минздрава России, г. Саратов.

Работа поступила в редакцию 24.11.2014.

Библиографическая ссылка