Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Арапова А.И. 1 Фомина М.А. 1

---

1 ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова»

Изучены показатели активности, коэффициента лабильности и доли секретируемой активности, а также коэффициента аутокаталитического действия лизосомальных цистеиновых протеиназ в миокарде и скелетной мышце крыс. Моделирование изменения уровня синтеза оксида азота осуществляли путем внутрижелудочного введения раствора L-аргинина. Контрольной группе вводили физиологический раствор. Активность катепсинов В, L и Н изучалась спектрофлуориметрическим методом по Barrett & Kirschke в двух фракциях – лизосомальной и внелизосомальной. В результате эксперимента были получены статистически значимые отличия от группы контроля (р < 0,05), на основании которых можно сделать следующие выводы: L-аргинин в дозе 500 мг/кг вызывает нарастание активности катепсинов В и Н в скелетной мускулатуре с одновременным снижением активности катепсина L, подавление секреции катепсинов В, L, Н в скелетной мускулатуре и катепсина В в миокарде, нарастание количества проферментных форм катепсина В в миокарде с параллельным снижением их содержания в скелетной мышце.

Статья в формате PDF

376 KB

L-аргинин

катепсины В

L

Н

активность лизосомальных цистеиновых протеиназ

лабильность лизосомальной мембраны

секретируемая активность

аутокаталитическое действие

1. Головченко Ю.И. Обзор современных представлений об эндотелиальной дисфункции/ Ю.И. Головченко, М.А. Трещинская // Consilium medicum Ukraina – 2008 – № 11 – C. 38–40.

2. Горчакова Н.О. Біохімія аргініну, фармакологічна дія і застосування в клінічній практиці його похідних / Н.О. Горчакова, А.С. Ягупова, І.С. Чекман // Науковий вісник НМУ ім. О.О. Богомольця. – 2006. – № 4. – С. 238–246.

3. Коровин М.С. Роль лизосомальных цистеиновых протеиназ в опухолевой прогрессии / М.С. Коровин, В.В. Новицкий, О.С. Васильева // Бюл. Сиб. медицины. – 2009. – № 2. – С. 85–91.

4. Марков Х.М. L-аргинин – оксид азота в терапии болезней сердца и сосудов // Кардиология. – М., 2005 – № 6. – С. 87–95.

5. Покровский М.В. Эндотелиопротекторные эффекты L-аргинина при моделировании дефицита окиси азота / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Корчаков [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2008. – Т. 71, № 2. – С. 29–31.

6. Сосунов А.А. Оксид азота как межклеточный посредник //Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т.6, № 12 – С. 27–34.

7. Фомина М.А., Абаленихина Ю.В. Способ оценки степени секреции лизосомальных цистеиновых протеиназ. Заявка на выдачу патента № 2013 125 639 (037767), приоритет от 03.06.2013.

8. Barrett A.J. Cathepsin B, Cathepsin H, cathepsin L // Methods in Enzymol. – 1981. – Vol. 80. – P. 535–561.

9. Chatterjee A. Endothelial nitric oxide (NO) and its pathophysiologic regulation / A. Chatterjee, J.D. Catravas // Vascul. Pharmacol. – 2008 – Vol. 49(4–6) – Р. 134–140.

10. Conus S. Cathepsins and their involvement in immune responses / S. Conus, S. Hans-Uwe // Swiss medical weekly. – 2010. – Р. 1–12.

Изучение биологического влияния оксида азота (II) (NO) началось с 80-х годов, когда Роберт Фуршготт и Дж. Завадски выяснили, что расширение кровеносных сосудов под влиянием ацетилхолина происходит только при наличии эпителиоподобных клеток, выстилающих внутреннюю поверхность всех сосудов. Вещество – NO, которое они выделяют в ответ на внешние воздействия, приводит к расширению сосудов, – получило название «сосудорасширяющий эндотелиальный фактор» [6]. Роль NO в поддержании сосудистого гомеостаза: регуляция сосудистого тонуса, пролиферации и апоптоза, оксидантных процессов, NO присущи ангиопротекторные свойства [4]; ответственен за противовоспалительные эффекты, производит фибринолитический эффект [6].

Учитывая важные физиологические функции NO в организме, можно не сомневаться, что в случае заболевания этот радикал будет вовлечен в развитие многих патологических реакций. В настоящее время активно изучают следующие группы заболеваний, для развития которых характерны изменения в обмене NO: болезни сердечно-сосудистой системы, в том числе гипертонию, инфаркт миокарда, легочную гипертензию, атеросклероз; инсульты и поздние дегенеративные заболевания нервной системы; различные аутоиммунные заболевания, диабет, отторжение трансплантатов; процессы острого и хронического воспаления различных органов и тканей, особенно эндотоксемию, отек, шок; цирроз печени, болезнь почек, легких, ЖКТ; онкологические заболевания [6].

Аргинин – условно незаменимая аминокислота, которая является субстратом для синтеза NO [9]. При низких концентрациях в плазме крови L-аргинин избирательно улучшает эндотелиальную функцию; при среднем уровне концентрации может оказывать прямую вазодилатацию вследствие стимуляции секреции инсулина и гормона роста; высокие уровни L-аргинина вызывают неспецифическую вазодилатацию [1]. Перспективность использования L-аргинина как полузаменимой аминокислоты в терапии ряда патологий известна давно [2, 4]. Однако в какой степени достигаемые эффекты (снижение артериального давления, коррекция эндотелиальной дисфункции при гиперхолестеринемии, терапия гломерулонефрита) опосредуются через NO, остается пока невыясненным.

Смерть клетки является одной из центральных проблем биологии и медицины, она может происходить двумя путями: путем апоптоза и в результате воздействия внешних факторов. Имеется значительное число научных публикаций, убедительно свидетельствующих об эффективном защитном действии NO против клеточного апоптоза. В настоящее время хорошо известно, что важным и значимым в диагностике показателем апоптоза (через активацию каспаз) является степень активации лизосомальных цистеиновых протеиназ. Экспрессию катепсинов часто связывают с развитием апоптоза [3]. Будучи секретированными или связанными с плазматической мембраной, катепсины способны разрушать белковые компоненты мембран и внеклеточного матрикса. Активация лизосомальных протеаз свидетельствует об иммунном ответе организма, их контроль позволит избежать патологических повреждений клеток и тканей [10].

Цель – определение изменения секреции лизосомальных цистеиновых протеиназ в миокарде и скелетной мышце крысы на фоне введения L-аргинина и в группе контроля.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на 12 конвенциональных половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 280–320 граммов. Моделирование изменения уровня синтеза оксида азота (II) субстратом NO-синтазы в экспериментальной группе (n = 6) осуществляли путем внутрижелудочного введения раствора L-аргинина («Sigma», США) на 0,9 % растворе NaCl в дозе 500 мг/кг [5] через стеклянный градуированный шприц с внутрижелудочным зондом. Объем вводимого раствора зависел от массы и не превышал 1 мл. Препарат вводили 1 раз в сутки до утреннего кормления ежедневно в течение 10 дней. Контрольной группе параллельно (n = 6) внутрижелудочно вводили физиологический раствор.

Содержание и выведение животных из эксперимента выполняли в соответствии с правилами, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказе МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

Активность кислых гидролаз в седиментируемой (СА) и неседиментируемой (НСА) фракциях определяли раздельно. Общую активность (ОА) рассчитывали как сумму СА и НСА. Коэффициент лабильности (К лаб, %) – это процентное отношение НСА к ОА, характеризует проницаемость лизосомальной мембраны для изучаемого фермента.

Активность катепсинов В, L и Н (КВ, КL, KH) изучалась спектрофлуориметрическим методом по Barrett & Kirschke [9].

Метод оценки степени секреции лизосомальных цистеиновых протеаз основан на одновременной оценке двух параметров – коэффициент лабильности катепсина и коэффициент лабильности кислой фосфатазы как показателей функционального состояния лизосомальной мембраны. Затем рассчитывается безразмерный биохимический показатель – доля секретируемой активности лизосомальных цистеиновых протеаз – коэффициент Wsecr: возрастание (положительное значение) данного показателя говорит о секреции катепсинов за счет проницаемости мембраны, а уменьшение (отрицательное значение) свидетельствует о нарушении целостности лизосомальной мембраны [7].

Степень аутокаталитического действия катепсинов оценивалась по коэффициенту отношения значения активности фермента после прекаталитической инкубации к параллельно определяемому значению активности без преинкубации (Kaca – коэффициент аутокаталитического действия).

Статистический анализ результатов исследования проведен с использованием программы «Statistica 10.0». Поскольку отмечалось отсутствие согласия большинства данных с нормальным распределением, вычисляли характеристики: медиану (Ме), минимальное (min) и максимальное (max) значения, результаты представлены в формате Ме [min; max], для оценки статистической значимости различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна – Уитни (U-тест).

Результаты исследования и их обсуждение

При оценке изменений активности изучаемых ферментов (табл. 1) обнаружено, что влияние L-аргинина не приводит к статистически значимым изменениям изучаемых показателей, за исключением статистически значимого снижения активности катепсина В в цитоплазматической (неседиментируемой) фракции.

В то же время в скелетной мускулатуре практически все изменения активности катепсинов оказались статистически значимыми. Так, общая активность катепсинов В и Н в скелетной мышце под влиянием L-аргинина нарастала, при этом изменения касались как лизосомальной (седиментируемой), так и цитоплазматической (неседиментируемой) фракций. При этом изменения активности катепсина L оказались противонаправленными: выраженное снижение общей и неседиментируемой активности с умеренным снижением седиментируемой активности.

Таблица 1

Влияние L-аргинина на показатели активности лизосомальных цистеиновых протеиназ в сердечной и скелетной мышцах (нмоль/с х г белка), Ме [min; max]

Примечание. * – статистически значимые отличия от группы контроля (р < 0,05).

Оценка показателей проницаемости лизосомальной мембраны (табл. 2) демонстрирует статистически значимое снижение Клаб, % для катепсина В в сердечной и скелетной мышцах по сравнению с группами контроля. Так, обнаружено, что данный фермент демонстрирует высокие показатели коэффициента лабильности лизосомальной мембраны в контрольной группе; эффект L-аргинина проявляется выраженным статистически значимым снижением этого параметра. Известно, что доля внелизосомальной активности и коэффициент лабильности лизосомальной мембраны для каждого из катепсинов может изменяться по двум причинам: изменение общей проницаемости лизосомальной мембраны и изменение степени секреции индивидуального фермента.

Таблица 2

Влияние L-аргинина на показатели коэффициентов лабильности и доли внелизосомальной активности лизосомальных цистеиновых протеиназ в мышечных тканях, Ме [min; max]

Примечание. * – статистически значимые отличия от группы контроля (р < 0,05).

Сочетание анализа изменений коэффициента лабильности лизосомальной мембраны с Wsecr (табл. 2) позволяет предполагать, что причиной выявленных сдвигов в сердечной и скелетной мышцах является уменьшение степени секреции катепсина В (статистически значимые снижения Wsecr в изучаемых органах) через неповрежденную мембрану, которая обладает дифференциальной проницаемостью для всех лизосомальных цистеиновых протеиназ. В случае с катепсинами L и Н в миокарде статистически значимых данных Клаб, % и Wsecr не обнаружено.

Заключение о подавлении секреции катепсинов L и Н скелетной мускулатуры в данной экспериментальной модели с нарушением целостности лизосомальной мембраны позволяют сделать статистически значимое снижение показателя Wsecr на фоне малых изменений показателей коэффициентов лабильности этих ферментов.

Миокард демонстрирует статистически значимое нарастание показателей Каса (рисунок) под действием L-аргинина для катепсина В в обеих субклеточных фракциях: НСА: 0,71 [0,34; 1,11] – 5,55 [1,7; 6,34]; CA 0,83 [0,31; 1,78] – 1,13 [0,59; 1,7] контрольная и опытная проба соответственно, следует заметить, что значительное увеличение НСА у исследуемых коэффициентов говорит о высокой степени аутопроцессинга данного фермента. Изменения коэффициентов для катепсинов L и Н в сердечной мышце оказались статистически не значимыми, однако катепсин Н повторяет изменения катепсина В, которые протекают не так ярко, что может говорить об аутокаталитической активации с созданием активных форм из проферментов.

В скелетной мышце, напротив, у катепсина В отмечается статистически значимое резкое снижение показателей Каса по сравнению с данными контрольной группой крыс в неседиментируемой и в седиментируемой фракциях: НСА 2,66 [0,54; 8,92] – 0,54 [0,11; 1,22]; CA 1,54 [0,11; 6,88] – 0,61 [0,35; 1,12] контрольная и опытная проба соответственно, что может быть результатом аутокаталитического расщепления или связыванием с растворимыми формами ингибиторов в процессе преинкубации в лизосомах и цитоплазме.

В то же время для катепсина L в данной ткани получено статистически значимое нарастание коэффициентов в седиментируемой (лизосомальной) фракции 0,09 [0,02; 0,38] – 1,16 [0,92; 1,52] контрольная и опытная проба соответственно, изменения наблюдаются при нарастании проферментных форм, что является фактором запуска аутокаталитического процессинга.

Диаграмма размаха коэффициента аутокаталитического действия миокарда (1) и скелетной мускулатуры (2)

Таким образом, введение субстрата синтеза NO L-аргинина приводит к изменению содержания в мышечных тканях проферментных и активных форм лизосомальных цистеиновых катепсинов; наибольшей чувствительностью при этом обладает катепсин В.

Выводы

1. L-аргинин в дозе 500 мг/кг вызывает нарастание активности катепсинов В и Н в скелетной мускулатуре с одновременным снижением активности катепсина L.

2. Введение L-аргинина приводит к снижению секреции всех изучаемых катепсинов в мышечной ткани и катепсина В в миокарде.

3. L-аргинин вызывает нарастание количества проферментных форм катепсина В в миокарде с параллельным снижением их содержания в скелетной мышце.

Емельянова А.С., д.б.н., профессор кафедры технологии производства и переработки продукции животноводства, ФГБОУ ВПО «Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.А. Костычева», г. Рязань;

Демихов В.Г., д.м.н., профессор, директор Рязанского филиала, ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачёва», г. Рязань.

Работа поступила в редакцию 10.12.2014.

Библиографическая ссылка