Распространенность женского бесплодия колеблется в пределах 60–70 % [6, 8, 12, 13]. Несмотря на важность проблемы и большое количество предположений, однозначного и удовлетворительного объяснения увеличения частоты бесплодия у пациенток с эндометриозом до сих пор не существует. В патогенезе генитального эндометриоза важная роль принадлежит нарушениям иммунного гомеостаза, в том числе и генетически обусловленным, предрасполагающим к определенному ответу иммунной системы на формирование эндометриоидных гетеротопий, их инвазию и распространение [1, 2, 4, 10, 11, 16].
В связи с этим является актуальным анализ аллельного полиморфизма генов иммунорегуляторных цитокинов при бесплодии, ассоциированном с эндометриозом, а также выявление рисковых комбинаций полиморфных генов цитокинов при эндометриозе и бесплодии, с целью оценки возможного вклада в патогенез заболевания.
Материал и методы исследования
Для достижения поставленной цели исследования и решения задач было обследовано 236 женщин с бесплодием, находившихся на стационарном лечении в гинекологическом отделении ФГБУ НИИ АГП СО РАМН, а также в гинекологической клинике ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, с 2010 по 2012 гг., подписавших информированное согласие на участие в исследовании. В программу исследования были включены женщины только европеоидного происхождения, проживающие на территории г. Томска и Томской области.
На стационарное лечение пациентки поступали на плановую лапароскопию и гистероскопию для уточнения причин бесплодия.
На основании лапароскопической картины и гистологического подтверждения диагноза все обследованные женщины были распределены на две группы: основная группа состояла из 145 пациенток, страдающих бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом. Критерии включения в исследование: бесплодие; репродуктивный возраст (21–40 лет); подтвержденный (лапароскопически и гистологически) диагноз наружный генитальный эндометриоз; информированное согласие женщины на участие в исследовании. Контрольная группа состояла из 91 женщины с бесплодием. У них по результатам лапароскопии и гистероскопии наружный генитальный эндометриоз был исключен.
Для исследования полиморфизма генов IL1B, IL2, IL4, IL6, IL10, IFNG, и TGFB выделение ДНК из периферической крови проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия). Исследование полиморфных участков генов цитокинов проводили с использованием аллель-специфической амплификации специфических участков генома. Амплификацию осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к набору «АмплиСенс-200-1» («ИнтерЛабСервис», Россия), в пробирках типа «Эппендорф» путём полимеразной цепной реакции, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе с применением амплификатора «Терцик МС2» («ДНК-технология», Россия). Было исследовано семь полиморфных вариантов семи генов цитокинов – 511С/Т гена IL1B (rs16944), T-330G гена IL2 (rs2069762), C-590T гена IL-4 (rs2243250), – 174G/C гена IL6 (rs1800795), C-592A гена IL10 (rs1800872), + 874А/Т гена IFNG (rs2340561), С-509Т гена TGFВ (rs1800469).
Для оценки уровня IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ и TGF-β в сыворотке крови использовали твердофазный иммуноферментный «сэндвичевый» метод (ELISA). Процедура выполнения иммуноферментного анализа (ИФА) проводилась по инструкции, предлагаемой производителем тест-систем («Протеиновый контур», Россия; «Biosource», США).
Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных алгоритмов биометрии с помощью программы Microsoft Exсel (2007), стандартного пакета программ SPSS® 17.0 for Windows. Для определения соответствия распределения количественных признаков нормальному закону использовали критерий Шапиро – Уилка. Проверку статистической значимости равенства выборочных средних, имеющих ненормальный закон распределения, проверяли с помощью U-критерия Манна – Уитни для двух групп и с помощью критерия Крускала – Уолиса для трех групп. Различия считались достоверными при уровне значимости p < 0,05 и p < 0,001. Для анализа качественных независимых данных использовали точный критерий Фишера и χ2 Пирсона. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди – Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для анализа ассоциации исследуемых генов с эндометриозом сравнивали частоты аллелей и генотипов, используя критерий χ2 с поправкой Йетса на непрерывность. При численностях генотипов менее пяти использовали точный тест Фишера. В дополнение к этому об ассоциации генотипов (или их комбинаций) с заболеванием судили по величине отношения шансов (OR).
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе настоящего исследования было установлено, что средний возраст всех обследованных женщин составил 30,22 ± 0,28 лет, длительность бесплодия у которых колебалась в пределах от 1 года до 11 лет. Среди женщин без эндометриоза чаще встречалось вторичное бесплодие – 52,7 % (p < 0,05), а у пациенток с эндометриозом статистически значимо чаще наблюдалось первичное бесплодие, частота которого составляла 67,6 % (p < 0,05). Среди женщин с бесплодием и эндометриозом у 21 (14,5 %) был отягощенный семейный анамнез по наличию эндометриоза (р < 0,05). Оперативные вмешательства на органах малого таза в анамнезе имели 34 (23 %) женщины с бесплодием и эндометриозом и 13 (14,3 %) пациенток контрольной группы (р > 0,05).
Основными лечебно-диагностическим методами, применяемыми нами для диагностики и хирургической коррекции бесплодия, сочетанного с эндометриозом, были лапароскопия и гистероскопия. По результатам лапароскопии у 60 (41,4 %) женщин были зарегистрированы эндометриодные кисты яичников, у 45 (31 %) – малые формы эндометриоза, а у 40 (27,6 %) женщин – сочетание эндометриодных кист яичников и малых форм эндометриоза (p < 0,05). Проводилось иссечение эндометриодных очагов и эндометриоидных кист яичников. Интраоперационно всем обследованным женщинам выполнялась хромогидротубация, по результатам которой установлено, что у 43 (47 %) пациенток контрольной группы и 92 (63,4 %) основной группы маточные трубы были непроходимы (p < 0,05).
В ходе лапароскопии у всех обследованных женщин был выявлен спаечный процесс органов малого таза различной степени. В ходе выполнения гистероскопии у обследованных женщин обеих групп патологии выявлено не было, что подтверждалось результатами гистологического исследования эндометрия.
Молекулярно-генетическими методами было установлено, что наличие одного или нескольких структурных полиморфизмов генов цитокинов оказывает влияние на функциональную активность или уровень экспрессии кодируемых белков [6, 7, 14, 16].
В связи с этим представляется актуальным анализ аллельного полиморфизма генов иммунорегуляторных цитокинов при бесплодии в сочетании с эндометриозом и без него. Проведенный нами анализ позволил установить, что аллель Т полиморфизма C511T гена IL1B являлся фактором риска развития эндометриоза, ассоциированного с бесплодием. Риск развития заболевания увеличивался почти в 3 раза. При этом аллель С обладал протективным эффектом (рис. 1). Нами получены данные о наибольшем уровне цитокина в группе инфертильных пациенток с бесплодием при наличии гомозиготного генотипа по аллелю Т (p < 0,05).
Рис. 1. Показатели относительного риска (OR) развития бесплодия, ассоциированного с эндометриозом, для носителей аллелей полиморфизма C511T гена IL1B, при р < 0,05
При сравнении распределения генотипов в двух группах пациенток было обнаружено, что у женщин с бесплодием и с бесплодием, сочетанным с эндометриозом, характер распределения генотипов полиморфизма Т-330G гена IL2 значимо не отличался. При анализе полиморфизма C-590T гена IL4 нами были получены следующие результаты. Показана положительная ассоциация генотипа ТТ и аллеля Т с бесплодием, сочетанным с эндометриозом, в то время как генотип СС полиморфизма C-590T гена IL4 обеспечивал протекцию в отношении сочетания эндометриоза и бесплодия (рис. 2).
Рис. 2. Показатели относительного риска (OR) развития бесплодия, ассоциированного с эндометриозом, для носителей аллелей и генотипов полиморфизма гена C-590T IL4, при р < 0,05
Также было установлено, что у женщин с бесплодием и эндометриозом, носителей гомозиготного генотипа ТТ полиморфизма C-590T гена IL4, статистически значимо повышена продукция IL-4 (р < 0,001). Основным синергистом IL-4 в реализации негативной цитокиновой регуляции провоспалительных функций иммунокомпетентных клеток является IL-10 [1, 9, 13, 14]. Данный цитокин продуцируется Т-регуляторными клетками и Th2-лимфоцитами и подавляет продукцию IFN-γ Th1-клетками. Кроме того, он тормозит пролиферативный ответ Т-клеток на антигены и митогены, а также подавляет секрецию активированными моноцитами IL-1β, TNF-α и IL-6 [3, 2, 6, 15]. В то же время IL-10 стимулирует секрецию Ig В-клетками [6, 11, 13].
В ходе исследования была установлена ассоциация риска развития бесплодия при эндометриозе с генотипом АА и аллелем A полиморфного сайта C-592A гена IL10. Также был отмечен протективный эффект гомозиготного генотипа по аллелю С данного полиморфизма (рис. 3).
Рис. 3. Показатели относительного риска (OR) развития бесплодия, ассоциированного с эндометриозом, для носителей аллелей и генотипов полиморфизма гена C-592А IL10, при р < 0,001
При анализе ассоциации аллельного полиморфизма генов цитокинов с их уровнем в сыворотке крови было зарегистрировано значимое увеличение концентрации IL-10 у женщин с эндометриозом и бесплодием, обусловленное носительством генотипа АА полиморфизма C-592A гена IL10 (p < 0,001). Таким образом, можно предположить, что носительство мутантного генотипа АА и повышение концентрации IL-10 в периферической крови у инфертильных женщин с эндометриозом взаимосвязано. Антагонистом IL-10 является IFN-γ. Согласно результатам исследования, у больных наружным генитальным эндометриозом было отмечено достоверное повышение содержания интерферона в периферической крови одновременно со снижением способности лимфоидных клеток к секреции гамма-интерферона [5] и, как следствие, редукция концентрации цитокина в перитонеальной жидкости [3, 9, 10, 12, 14]. Однако при анализе распределения генотипов и аллелей полиморфизма генотипа локуса A-874T гена IFNG у инфертильных женщин без эндометриоза и у женщин с бесплодием и эндометриозом статистически значимых различий нами выявлено не было.
Известно, что продуцируемый клетками иммунной системы IL-6 выступает в качестве ко-фактора при дифференцировке В-лимфоцитов , их созревании и преобразовании в плазматические клетки, секретирующие иммуноглобулины. Он может выступать как провоспалительный, так и противовоспалительный цитокин. В промоторной области гена IL6 находится полиморфный участок G(-174)C, аллель С которого ассоциирован c пониженным уровнем IL-6 в плазме [15].
В ходе проведенного нами исследования было установлено значимое увеличение частоты генотипа СС и аллеля С полиморфизма G-174C гена IL6 у женщин с бесплодием, ассоциированным с эндометриозом.
Таким образом, нами было показано, что фактором риска ассоциации бесплодия с эндометриозом являлся аллель C и генотип СС, а защитным эффектом обладал генотип GG локуса G-174C гена IL6 (рис. 4).
Рис. 4. Показатели относительного риска (OR) развития бесплодия, ассоциированного с эндометриозом, для носителей аллелей и генотипов полиморфизма гена G-174C гена IL6, при р < 0,001. Важную роль в развитии иммунного ответа при эндометриозе играет TGF-β
Результаты анализа сайта С-509Т гена TGFВ у женщин с бесплодием и эндометриозом показали преобладание гомозиготного генотипа CС, в то время как самым редким генотипом был TT, аналогичную тенденцию имело распределение частот встречаемости генотипов в группе пациенток, страдающих бесплодием без эндометриоза.
По полученным нами данным при носительстве аллеля Т риск развития бесплодия, сочетанного с эндометриозом, увеличивается в 1,7 раза, а в случае наличия генотипа ТТ локуса С-509Т гена TGFВ в 2,4 раза (рис. 5).
Рис. 5. Показатели относительного риска (OR) развития бесплодия, ассоциированного с эндометриозом, для носителей аллелей и генотипов полиморфизма гена С-509Т гена TGFВ, при р < 0,05
Отдельные аллельные варианты генов цитокинов малоинформативны для прогнозирования развития эндометриоза и ассоциированного с ним бесплодия, тогда как анализ их комбинаций может дать более полноценный индивидуальный прогноз.
Нами был проведен анализ сочетаний генотипов полиморфизма C511T гена IL1B, полиморфизма С-590T гена IL4, полиморфизма G-174C гена IL6, полиморфизма С-592A гена IL10, полиморфизма C-509T гена TGFB, в результате которого мы определили протекторные, предрасполагающие и интактные комбинации к развитию инфертильности, сопровождающейся эндометриозом.
Ввиду того, что статистически значимых различий в распределении генотипов полиморфных вариантов полиморфизма T-330G гена IL2 и полиморфизма A-874T гена IFNG у обследованных женщин получено не было, мы не включили в анализ сочетаний полиморфных маркеров данные показатели (таблица).
Рисковые комбинации полиморфных вариантов генов C511T гена IL1B, С-590T гена IL4, G-174C гена IL6, С-592A гена IL10, C-509T гена TGFB у женщин с бесплодием и эндометриозом
|
Комбинации генотипов |
OR (CI95 %) |
|
IL1BCC + IL4CC + IL6GG + IL10CC + TGFBТT |
9,931 (1,176 – 83,875) |
|
IL1BCТ + IL4CC + IL6GG + IL10CА + TGFBТТ |
20,854 (4,758 – 91,409) |
|
IL1BCC + IL4CT + IL6GG + IL10CC + TGFBCC |
2,281 (2,02 – 2,146) |
Примечание. Анализ качественных независимых данных проводили с помощью критерия χ2 Пирсона или точного критерия Фишера. р – уровень статистической значимости различий между группами. Статистически значимые различия считали при р < 0,05; χ2 = 16,18; χ2 = 13,1 соответственно. OR – критерий отношения шансов, отражающий относительный риск развития заболевания при определенном генотипе по сравнению со здоровыми донорами с 95 % доверительным интервалом.
Таким образом, бесплодие, ассоциированное с эндометриозом, характеризуется выраженными сдвигами в системе цитокинов, которые приводят к изменениям, предрасполагающим к развитию бесплодия.
Нами определен вклад как отдельных генных полиморфизмов, так и их сочетаний в увеличении рисковых шансов развития инфертильности в сочетании с наружным генитальным эндометриозом. К факторам риска нарушения репродуктивной функции у женщин с наружным генитальным эндометриозом можно отнести носительство рисковых комбинаций генотипов CC гена IL1B + CC гена IL4 + GG гена IL6 + CC гена IL10 + ТT гена TGFB; CТ гена IL1В + CC гена IL4 + GG гена IL6 + CА гена IL10 + ТТ гена TGFВ; CC гена IL1B + CT гена IL4 + GG гена IL6 + CC гена IL10 + CC гена TGFB. Выявленные рисковые комбинации генотипов позволят оптимизировать подход к обследованию женщин с бесплодием на этапе первичного обращения с целью определения дальнейшей тактики ведения пациенток в пользу применения вспомогательных репродуктивных технологий.
Рецензенты:Сотникова Л.С., д.м.н., профессор кафедры акушерства и гинекологии ФПК и ППС, ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Томск;
Агафонов В.И., д.м.н., профессор кафедры патофизиологии, ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Томск.
Работа поступила в редакцию 25.12.2014.
Библиографическая ссылка
Агаркова Т.А., Кублинский К.С., Наследникова И.О., Евтушенко И.Д., Агаркова Л.А., Новицкий В.В. ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РИСКА НАРУШЕНИЯ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ У ЖЕНЩИН С НАРУЖНЫМ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 10-8. – С. 1445-1450;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=36333 (дата обращения: 25.04.2024).