Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

ИЗУЧЕНИЕ ФЕНОТИПИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ PSEUDOMONOS AERUGINOSA

Диц Е.В. 1
1 ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздрава России
Установлена фенотипическая изменчивость P. aeruginosa в организме кроликов породы «шиншилла» и во внешней среде, проявляющаяся в изменении биологических свойств бактерий (переход бактерий из культивируемых форм в некультивируемые и наоборот ‒ из некультивируемых форм – в культивируемые) и антибиотикорезистентности к антимикробным препаратам. Диаметр задержки роста к антибиотикам у некультивируемых бактерий был на 6,8 ± 0,9 мм меньше по сравнению с культивируемыми бактериями. Выявлена изменчивость P. aeruginosa, позволяющая сохранить возбудитель инфекционного заболевания как вид. Поэтому открываются новые возможности в совершенствовании эпидемиологического надзора за возбудителями инфекционных заболеваний, а именно, проведение мониторинга за возбудителями инфекционных заболеваний в некультивируемой форме.
фенотипическая изменчивость
культивируемые и некультивируемые бактерии
антибиотикорезистентность
1. Грузина В.Д. Коммукативные сигналы бактерий // Антибиотики и химиотерапия. – 2003. – Т. 48, № 10. – С. 32–39.
2. Назаров И.П., Винник Ю.С. Интенсивная терапия критических состояний. – Т. 2. – 2-е изд. – (лекционный курс). – Омск, 2002. – 336 с.
3. Пронина Е.А. Влияние электромагнитного излучения на частоте молекулярного спектра поглощения и излучения оксид азота на изменение активности супероксиддисмутазы бактерий // Саратовский научно-медицинский журнал. – 2009. – Т. 5. – № 2.
4. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Бактериальная биоплёнка как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина // Микробиология. – 2011. – № 3. – С. 99–109.
5. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Цитокины – возможные активаторы роста патогенных бактерий // Вестник РАМН. – 2000. – № 1. – С. 13–18.
6. Бергхоф П.К. Мелкие домашние животные. Болезни и лечение. – М.: Аквариум, 1999. – 224 с.
7. Определитель бактерий Берджи: пер. с англ. – В 2-х т. / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямс. – М.: Мир, 1997. – Т. 1. – 432 с.; Т. 2 – 368 с.
8. Способ выделения некультивируемых бактерий стафилококка: пат. 2470074 Рос. Федерации МПК C12Q 1/04 / Козлов Л.Б. с соавт.; заявитель и патентообладатель Козлов Л.Б., Санников А.Г. – № 2011146052/10; заявл. 14.11.2011; опубл.20.12.2012, Бюл. № 35.
9. Образование «некультивируемых» клеток Micobacterium tuberculosis и их оживление / М.О. Шлеева, Г.В. Мукамолова, М.В. Телков [и др.] // Микробиология. – 2003. – Т. 72. – № 1. – С. 76–83.
10. Волянський Ю.Л. Некультурабельний стан аспорогенних бактерій: теоретичні аспекти проблеми та її практична значущість // Інфекційні хвороби. – 2004. – № 1. – С. 5–9.
11. Тафельштейн Э.А. Экспериментальное получение некультивируемых форм Vibrio cholera eeltor и характеристика их биологических свойств / Э.А. Тафельштейн, Е.П. Голубинский, А.С. Марамович [и др.] // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004. no. 1. – С. 13–18.

В микробных популяциях под влиянием экологических факторов формируется определенное количество бактерий с признаками анабиоза, они не культивируются в лабораторных условиях [1, 9, 10, 11]. Иногда даже значительное количество бактерий может переходить в жизнеспособное некультивируемое состояние [2, 3, 4, 5]. Это свойство бактерий можно рассматривать как своеобразную форму сохранения микроорганизма как вида.

Цель исследований – изучение мониторинга фенотипической изменчивости P. aeruginosa в связи с возникновением ИСМП.

Задачи

1. В опытах на кроликах породы шиншилла изучить мониторинг фенотипической изменчивости P. aeruginosa, проявляющейся в переходе культивируемых форм бактерий в некультивируемые и наоборот в зависимости от экологических условий окружающей среды.

2. Изучить антибиотикорезистентность культивируемых и некультивируемых бактерий P. aeruginosa.

3. Установить эпидемиологическую значимость некультивируемых форм P. aeruginosa в возникновении ИСМП.

Материалы и методы исследований

Экспериментальные исследования на кроликах породы шиншилла проведены на базе вивария ФГБОУ ВПО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья». Под наблюдением находилось 26 кроликов. Здоровых животных массой 2500–3500 грамм содержали в клетках в соответствии с требованиями санитарных правил (Утв. Главным Государственным санитарным врачом № 1045-73). В виварии поддерживали температуру воздуха 24–26 °С в соответствии с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 и требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации. Для изучения фенотипической изменчивости бактерий P. aeruginosa были взяты здоровые кролики с нормальными физиологическими показателями [6].

Под наблюдением находилось 2 группы животных. Одной группе животных вводили подкожно культивируемые бактерии P. aeruginosa и S. aureus в концентрациях 105 степени микробных клеток, а другой – некультивируемые бактерий P. аeruginosa и S. aureus в такой же концентрации.

Микробиологические исследования проводили по общепринятым методикам в соответствии с требованиями приказа М3 РФ № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». Идентифицировали бактерии, используя руководство Берджи [7], выделение некультивируемых бактерий проводили по методике, предложенной Л.Б. Козловым с соавт. [8]. В различные сроки инфекционного процесса кроликов вскрывали и определяли концентрацию культивируемых и некультивируемых бактерий P. aeruginosa в органах животных, а также определяли наличие бактерий P. aeruginosa в воздухе и на различных предметах вивария. Всего проведено 326 микробиологических исследований.

Для изучения микробной обсемененности внутренних органов животных использовали метод определения «бактерийного индекса» селезенки. После извлечения органа в асептических условиях его взвешивали на электронных лабораторных весах JW-1 высокого класса точности. На каждые 100 мг веса органа прибавляли 1 мл стерильного изотонического раствора NaCL и в стерильной ступке путем растирания получали основную взвесь тканей органов. Затем из основной взвеси делали ряд последовательных десятикратных разведений и 0,1 мл каждого разведения высевали на элективные. питательные среды. Через 24 часа роста бактерий при 37 °С подсчитывали количество выросших колоний. Показателем «бактериального индекса» являлось среднее число выросших колоний, полученных после посева органов от нескольких животных, взятых в опыт.

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью компьютерной программы Statistika v 6.0, с использованием средней арифметической ошибки (М ± m).

Результаты исследования и их обсуждение

На 8 день после инфицирования кроликов культивируемыми бактериями происходила транслокация бактерий P. aeruginosa в легочную ткань и печень. В легких определялись культивируемые бактерии в количестве 3,0 ± 0,3∙103, а в печени – 6,95 ± 0,2∙104 микробных клеток в 1 грамме ткани животного. В стадии реконвалесценции инфекционного заболевания в почках наблюдался переход культивируемых бактерий в некультивируемое состояние (табл. 1).

В период клинических проявлений болезни после инфицирования кроликов некультивируемыми бактериями наблюдался переход некультивируемых бактерий P. aeruginosa в культивируемое состояние. В печени животных на 2–6 сутки культивируемые бактерии P. aeruginosa определялись в количестве 7,3 ± 1,4∙102 микробных клеток в 1 грамме печени. В период реконвалесценции (на 8–21 день после заражения животных) из печени выделить культивируемые бактерии P. aeruginosa не удалось. В почках наблюдался переход культивируемых бактерий в некультивируемое состояние (табл. 2).

Таблица 1

Концентрация культивируемых и некультивируемых бактерий P. aeruginosa в почках животных в различные периоды инфекционного заболевания

Сроки обследования животных (в сутках)

Количество культивируемых бактерий

Количество некультивируемых бактерий

8

4,6 ± 0,1∙104

0

9

3,2 ± 0,1∙103

0

11–13

0

24,1 ± 12,2∙101

21

0

32,6 ± 11,4∙103

Примечание. 0 – бактерии не выделялись.

Таблица 2

Концентрация культивируемых и некультивируемых бактерий P. aeruginosa в почках животных в различные периоды инфекционного заболевания

Сроки обследования животных (в сутках)

Количество культивируемых бактерий

Количество некультивируемых бактерий

2

2,0 ± 0,3∙102

0

6

0,6 ± 0,1∙102

0

8

0

22,3 ± 10,7∙101

21

0

29,6 ± 13,2∙102

Примечание. 0 – бактерии не выделялись.

Через 21 день после проведения экспериментов на кроликах в виварии проведено исследование воздуха методом аспирации с использованием пробоотборного устройства ПУ-1Б и проведены смывы с различных предметов в виварии. Результаты исследований показали, что культивируемые бактерии в помещении вивария не определялись, а концентрация некультивируемых бактерий в воздухе достигала 101, а на исследуемых поверхностях вивария достигала 103 микробных клеток в 1 мл смыва.

Проведенные исследования показали, что наблюдается фенотипическая изменчивость возбудителя инфекционного заболевания P. aeruginosa. В зависимости от экологических условий существования P. aeruginosa при микробиологических исследованиях определялись культивируемые и/или некультивируемые формы микроорганизма. Под влиянием защитных специфических и неспецифических факторов макроорганизма, а также при неблагоприятных условиях существования микроорганизма во внешней среде культивируемые бактерии переходили в некультивируемое состояние, а при создании благоприятных условий для размножения в макроорганизме бактерии переходили в культивируемое состояние и вызывали развитие инфекционного процесса в организме кроликов. Выявленная фенотипическая изменчивость P. aeruginosa позволяет сохранить возбудитель инфекционного заболевания как вид в неблагоприятных условиях окружающей среды.

Наблюдаемые изменения фенотипической изменчивости P. aeruginosa можно представить в виде следующей схемы (рисунок).

Изучена антибиотикорезистентность культивируемых и некультивируемых бактерий P. aeruginosa, выделенных от больных с различными клиническими инфекционными заболеваниями, находящихся на стационарном лечении в клиниках г. Тюмени. Под наблюдением находилось 116 больных. Использовали диски со следующими антибиотиками: ампициллин, имипенем, рифампицин, цефтриаксон и гентамицин. По результатам роста на среде Мюллера – Хинтона выделенных культур P. aeruginosa установлено, что имеются различия в диаметрах задержки роста бактерий к различным антибиотикам у культивируемых и некультивируемых бактерий. Диаметр задержки роста к антибиотикам у некультивируемых бактерий был на 6,8 ± 0,9 мм меньше по сравнению с культивируемыми бактериями. Различие в антибиотикорезистентности культивируемых и некультивируемых бактерий P. aeruginosa также свидетельствует о фенотипической изменчивости данного вида бактерий.

pic_21.wmf

Принципиальная схема фенотипической изменчивости P. aeruginosa в зависимости от экологии возбудителя. Условные обозначения: – Некультивируемые бактерии P. aeruginosa – Культивируемые бактерии P. aeruginosa

Результаты проведенных микробиологических исследований показали, что между синегнойной палочкой и золотистым стафилококком наблюдался односторонний антагонизм. Поэтому условий для репродукции S. aureus не наблюдалось.

Заключение

Выявленная фенотипическая изменчивость P. aeruginosa, позволяющая сохранить возбудитель инфекционного заболевания как вид в неблагоприятных условиях существования, открывает новые возможности в совершенствовании эпидемиологического надзора за возбудителями инфекционных заболеваний, а именно проведение мониторинга за возбудителями инфекционных заболеваний по выявлению некультивируемых форм бактерий в макроорганизме и во внешней среде. Проведение эпидемиологического надзора за возбудителями инфекционных заболеваний с учетом их фенотипической изменчивости (переход культивируемых форм бактерий в некультивируемые и наоборот) позволит совершенствовать эпидемиологический надзор за ИСМП в ЛПУ.

Рецензенты:

Мальчевский В.А., д.м.н., главный научный сотрудник отдела протекторных механизмов репродуктивных систем криосферы, ФГБУН «Тюменский научный центр» СО РАН, г. Тюмень;

Разин М.П., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой детской хирургии, Кировская государственная медицинская академия, г. Киров.

Работа поступила в редакцию 02.02.2015.


Библиографическая ссылка

Диц Е.В. ИЗУЧЕНИЕ ФЕНОТИПИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ PSEUDOMONOS AERUGINOSA // Фундаментальные исследования. – 2015. – № 1-1. – С. 72-75;
URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=36769 (дата обращения: 28.03.2024).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1,674