Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР-ПДРФ НА ПРИМЕРЕ DGAT1-ГЕНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Тюлькин С.В. 1 Вафин Р.Р. 1 Муратова А.В. 2 Хатыпов И.И. 3 Загидуллин Л.Р. 4 Рачкова Е.Н. 4 Ахметов Т.М. 4 Равилов Р.Х. 4
1 ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория»
2 ООО «АМС Медиа»
3 ООО УК «Просто молоко»
4 ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины»
Целью настоящей работы являлась разработка эффективного способа детекции единичных нуклеотидных замен (SNP) и идентификации аллельных вариантов генов на основе ПЦР-ПДРФ-анализа. Нами разработан и апробирован на примере генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1 способ проведения ПЦР-ПДРФ, отличающийся от аналога тем, что на этапе ПЦР в постановке «Single PCR» используются три праймера, два из которых являются аллельспецифичными, а третий праймер – общий для обоих аллелей анализируемого гена. Праймеры DGAT1-1 + DGAT1-2 + DGAT1-3 инициируют амплификацию участка DGAT1-гена крупного рогатого скота длиной 100 bp, соответственно DGAT1-ПДРФ-TaqI профиль АА = 82/18 bp, КК = 100 bp и АК = 100/82/18 bp. Проведение ПДРФ-анализа позволило идентифицировать генотипы и аллели гена по соответствующим ПДРФ-TaqI-профилям; это говорит о том, что предложенный и апробированный нами новый способ ПЦР-ПДРФ эффективен и его можно применить для идентификации генотипов и аллелей других генов.
ДНК
ПЦР-ПДРФ
праймер
метод
ген DGAT1
аллель
крупный рогатый скот
1. Зарипов О.Г. Генотипирование крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина методами ДНК-технологии: дис. … канд. биол. наук. –Казань, 2010. – С. 30.
2. Зиннатова Ф.Ф., Зинатов Ф.Ф. Роль генов липидного обмена (DGAT1, TG5) в улучшении хозяйственно-полезных признаков крупного рогатого скота // Учёные записки Казанской ГАВМ. – 2014. – Т. 219. – С. 164–168.
3. Патент РФ № 2528743 C1, 20.09.2014.
4. Chikuni K. Identification of bovine kappa-casein genotypes using polymerase chain reaction method // J. Zootechn. Sci. – 1991. – № 7. – Р. 654–659.
5. Jacobson D. R., Moskovits T. Rapid, nonradioactive screening for activating ras oncogene mutations using PCR-primer introduced restriction analysis (PCR-PIRA) // PCR Methods Appl. – 1991. – Vol. 1. – № 2. – P. 146–148.
6. Komisarek J., Michalak A. A relationship between DGAT1 K232A polymporphism and selected reproductive traits in Polish Holstein-Friesian cattle // Anim. Sci. Pap. and Rep. – 2008. – Vol. 26. – № 2. – P. 89–95.
7. Velmala R., Mantysaari E.A., Maki-Tanila A. Molecular genetic polymorphism at the k-casein and B-lactoblobulin loci in Finish diary bulls // Ari. Sci. Finl. – 1993. – Vol. 2. – P. 431–435.

Наиболее удобным методом диагностики аллельного полиморфизма ряда генов отвечающих за хозяйственно полезные признаки сельскохозяйственных животных, является ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов). Благодаря своей простоте и точности он получил широкое распространение в диагностических научно-исследовательских учреждениях [1]. Суть данного метода в том, что происходит амплификация участка определённого (исследуемого) гена, несущего сайт узнавания для эндонуклеазы, с последующим разрезанием его соответствующим ферментом. По длине образовавшихся фрагментов (ПДРФ) делают заключение о наличии / отсутствии искомых аллелей у индивидуума [4, 7].

Одним из важных генов липидного обмена у крупного рогатого скота является ген диацилглицерол О-ацилтрансферазы (DGAT1). Исследования, проведённые на коровах-первотёлках холмогорской породы татарстанского типа, продемонстрировали, что наилучшие показатели молочной продуктивности имели аналоги, несущие в своём геноме K-аллель гена DGAT1 [2]. В связи с этим исследования, касающиеся разработки методов изучения аллельного полиморфизма гена DGAT1, актуальны и представляют научный интерес.

Цель настоящей работы – разработка эффективного способа детекции единичных нуклеотидных замен (SNP) и идентификации аллельных вариантов генов на основе ПЦР-ПДРФ-анализа.

Материалы и методы исследования

Экстракция нуклеиновой кислоты из образцов цельной крови крупного рогатого скота, консервированной 10 мМ ЭДТА-Na2, осуществлялась сорбционным способом («ДНК-сорб B», ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

Разработанный способ проведения ПЦР-ПДРФ апробирован на примере генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1.

Анализ локуса гена DGAT1 при проведении ПЦР-ПДРФ. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объёме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 5 % DMSO, 0,25 мМ dNTP, 1 ед. Taq ДНК полимеразы, по 0,25 мкМ праймеров DGAT1-1: 5/-ccgcttgctcgtagctttcgaaggtaacgc-3/ и DGAT1-2: 5/-ccgcttgct cgtagctttggcaggtaacaa-3/, по 0,5 мкМ праймера DGAT1-3: 5/-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3/ [3] для амплификации фрагмента гена DGAT1 длиной 100 пар нуклеотидов, 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:

×1: 94 °С – 4 мин; ×40: 94 °С – 10 с, 72 °С – 10 с;

×1: 72 °С – 5 мин.; хранение: 4 °С.

Для определения аллельного полиморфизма гена DGAT1 по вариантам А и К 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 20 ед. эндонуклеазы рестрикции TaqI в 1×буфере «Y» фирмы СибЭнзим (Россия) при 65 °C в течение ночи.

Детекцию результатов ПЦР-ПДРФ осуществляли методом горизонтального электрофореза в 3 % агарозном геле в буфере ТBE (рН 8,0), содержащем этидий бромида в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ = 310 нм).

Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.

Исследования по определению полиморфных вариантов гена DGAT1 у 70 чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей проводились в ГУП ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан.

Результаты исследования и их обсуждение

Одним из подходов к детекции единичных нуклеотидных замен (SNP) и идентификации аллельных вариантов генов является способ ПЦР-ПДРФ (PCR-RFLP), включая её модификацию – PCR-PIRA (PCR-primer introduced restriction analysis), являющуюся ближайшим аналогом предлагаемого способа [5, 6].

Нами разработан и апробирован на примере генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и К гена DGAT1, схожий с прототипом [6], способ проведения ПЦР-ПДРФ, включающий подготовку пробы нуклеиновой кислоты, внесение указанной пробы в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из деионизированной воды, дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, праймеров, проведение ПЦР, последующее эндонуклеазное расщепление ПЦР-продукта рестриктазой и детекцию полученных ПЦР-ПДРФ-фрагментов методом гель-электрофореза, отличающийся тем, что на этапе ПЦР в постановке «Single PCR» используются три олигонуклеотидных праймера, два из которых являются аллельспецифичными, но с заданным идентификационным сайтом рестрикции для одного из них, а третий праймер – общий для обеих аллелей анализируемого гена.

pic_86.tif

Рис. 1. Результаты выравнивания и TaqI-рестрикционного картирования амплифицируемых с помощью трёх праймеров DGAT1-1 + DGAT1-2 + DGAT1-3 нуклеотидных последовательностей ДНК локуса DGAT1-гена Bos Taurus (аллели А и К)

pic_87.tif

Рис. 2. Электрофореграмма результата TaqI-ПЦР-ПДРФ-идентификации аллелей А и К гена диацилглицерол О-ацилтрансферазы крупного рогатого скота с использованием трёх праймеров DGAT1-1 + DGAT1-2 + DGAT1-3 и рестриктазы TaqI. Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp + 50 bp (СибЭнзим); 1–4, 6, 8–11, 13, 15, 17–18) TaqI-ПЦР-ПДРФ-профиль генотипа АК (100/82/18); 5, 16) TaqI-ПЦР-ПДРФ-профиль генотипа АА (82/18 bp); 7, 12, 14) TaqI-ПЦР-ПДРФ-профиль генотипа КК (100 bp)

Процесс валидации способа проведения ПЦР для идентификации аллельных вариантов DGAT1-гена крупного рогатого скота осуществляли с учётом анализа выравнивания фланкируемых тремя праймерами DGAT1-1 + DGAT1-2 + DGAT1-3 (рис. 1) и путём тестирования протокола ПЦР-ПДРФ (рис. 2).

Праймеры DGAT1-1 + DGAT1-2 + DGAT1-3 инициируют амплификацию участка DGAT1-гена крупного рогатого скота длиной 100 bp, соответственно DGAT1-ПДРФ-TaqI профиль АА = 82/18 bp, КК = 100 bp и АК = 100/82/18 bp.

После проведения ДНК-анализа 70 быков-производителей распределение животных по генотипам локуса гена DGAT1 было следующим: 38 (54,3 %) быков имели гомозиготный генотип АА; 28 (40,0 %) – гетерозиготный генотип АК и 4 (5,7 %) быка с гомозиготным генотипом КК. При этом частота аллеля А составила 0,74, а аллеля К – 0,26.

Вывод

По результатам практических исследований, направленных на апробацию разработанного нами способа проведения ПЦР-ПДРФ, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации генотипов (на примере генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1) ввиду корректной интерпретации генерируемых генотип-специфичных фрагментов.

Рецензенты:

Алимов А.М., д.вет.н., профессор кафедры биологической и неорганической химии, Казанская государственная академия ветеринарной медицины, г. Казань;

Софронов В.Г., д.вет.н., профессор кафедры зоогигиены, Казанская государственная академия ветеринарной медицины, г. Казань.

Работа поступила в редакцию 17.04.2015.


Библиографическая ссылка

Тюлькин С.В., Вафин Р.Р., Муратова А.В., Хатыпов И.И., Загидуллин Л.Р., Рачкова Е.Н., Ахметов Т.М., Равилов Р.Х. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР-ПДРФ НА ПРИМЕРЕ DGAT1-ГЕНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА // Фундаментальные исследования. – 2015. – № 2-17. – С. 3773-3775;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=37855 (дата обращения: 05.07.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074