Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,441

ПРОБЛЕМЫ МАСШТАБИРОВАНИЯ В ВОДНОЙ СРЕДЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ПРОДУКТА АЗОТНОКИСЛОЙ ОБРАБОТКИ ПЛОДОВЫХ ОБОЛОЧЕК ОВСА – ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ БИОСИНТЕЗА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

Байбакова О.В. 1
1 ФГБУН Институт проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения Российской академии наук
В данной работе рассмотрены проблемы перехода от ацетатного буфера к водной среде в процессе ферментативного гидролиза и масштабирования в водной среде ферментативного гидролиза продукта азотнокислой обработки плодовых оболочек овса. Показано, что при переходе к водной среде выход редуцирующих веществ от массы субстрата снижается на 4,1 % по сравнению с ацетатным буфером. Кривые накопления концентрации редуцирующих веществ показывают, что концентрация редуцирующих веществ увеличивалась экспоненциально и через 24 ч от начала ферментативного гидролиза достигла значений от (32,3 ± 0,2) г/л до (48,8 ± 0,2) г/л. Установлено, что при поэтапном масштабировании ферментативного гидролиза по объему в водной среде происходит снижение выхода редуцирующих веществ: в колбе объемом 1 л выход редуцирующих веществ составил (73,3 ± 0,3) % от массы субстрата, а при переходе к ферментеру объемом 11 л выход снизился еще на 9 % и составил (64,3 ± 0,2) % от массы субстрата. В емкостном оборудовании объемом 63 л благодаря постоянному контролю и корректировке активной кислотности был достигнут выход РВ (66,0 ± 0,2) % от массы субстрата.
плодовые оболочки овса
азотнокислая обработка
ферментативный гидролиз
питательная среда
бактериальная целлюлоза
производственные условия
1. Schumann A.D. Artificial vascular implants from bacterial cellulose: preliminary results of small arterial substitutes / A.D. Schumann, J. Wippermann, O.D. Klemm, F. Kramer, D. Koth, H. Kosmehl, T. Wahlers, S. Salehi-Gelani // Cellulose. – 2009. – № 16. – P. 877–885.
2. Hestrin S. Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum: II. Preparation of freeze-dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose / S. Hestrin, M. Schramm // Journal of Biochemistry. – 1954. – № 58. – P. 345–352.
3. Гладышева Е.К. Биосинтез бактериальной целлюлозы на ферментативном гидролизате технической целлюлозы из плодовых оболочек овса / Е.К. Гладышева, Е.А. Скиба // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. – 2017. – Т. 7, № 1. – С. 140–146.
4. Байбакова О.В. Масштабирование на опытном производстве процесса получения биоэтанола из плодовых оболочек овса, предобработанных разбавленной азотной кислотой / О.В. Байбакова, Е.А. Скиба, В.В. Будаева, Г.В. Сакович // Катализ в промышленности. – 2017. – Т. 17, № 2. – С. 145–152.
5. Скиба Е.А. Биосинтез кормовых дрожжей на средах, полученных из плодовых оболочек овса / Е.А. Скиба // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. – 2016. – № 3. – С. 140–142.
6. Якушева А.А. Нитраты целлюлозы из нового источника целлюлозы – плодовых оболочек овса / А.А. Якушева // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 8–2. – С. 360–364.
7. Скиба Е.А. Ферментативный гидролиз лигноцеллюлозных материалов в зависимости от способа их подготовки / Е.А. Скиба, Т.О. Момот, Н.В. Бычин, В.Н. Золотухин // Ползуновский вестник. – 2013. – № 3. – С. 197–202.
8. Agrawal R. Pilot scale pretreatment of wheat straw and comparative evaluation of commercial enzyme preparations for biomass saccharification and fermentation / R. Agrawal, A. Satlewal, R. Gaur, A. Mathur, R. Kumar, R.P. Gupta, D.K. Tuli // Biochemical Engineering Journal. – 2015. – № 102. – Р. 54–61.
9. Baeyens J. Challenges and opportunities in improving the production of bio-ethanol / J. Baeyens, Q. Kang, L. Appels, R. Dewil, Lv. Yongqin, T. Tan // Progress in Energy and Combustion Science. – 2015. – № 47. – Р. 60–88.
10. Оболенская А.В. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы / А.В. Оболенская, З.П. Ельницкая, А.А. Леонович. – М.: Экология, 1991. – 320 c.
11. Budaeva V.V. Kinetics of the Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosic Materials at Different Concentrations of the Substrate / V.V. Budaeva, E.A. Skiba, O.V. Baibakova, E.I. Makarova, S.E. Orlov, A.A. Kukhlenko, E.V. Udoratina, T.P. Shcherbakova, A.V. Kuchin, G.V. Sakovich // Catalysis in Industry. – 2016. – Vol. 8, № 1. – P. 81–87.
12. Гладышева Е.К. Биосинтез бактериальной целлюлозы культурой Мedusomyces gisevii / Е.К. Гладышева, Е.А. Скиба // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий – 2015. – № 3. – С. 149–156.

Стремительное развитие биотехнологической промышленности стало одним из ключевых трендов мировой науки. Особое внимание при этом уделяется процессу биосинтеза бактериальной целлюлозы (БЦ) [1]. Ученые всего мира считают БЦ уникальным материалом будущего, который может быть использован в различных отраслях. Широкое применение БЦ нашла в медицине – гель-пленки БЦ можно использовать в микрохирургии при протезировании кровеносных сосудов [1], также на их основе можно восстанавливать суставные хрящи у больных, страдающих от болей в суставах и потери подвижности. Для биосинтеза БЦ классической является стандартная синтетическая среда [2], она была многократно модифицирована, однакоо ее дороговизна увеличивает стоимость целевого продукта [2].

В ИПХЭТ СО РАН предложено получать питательную среду из отходов сельского хозяйства – плодовых оболочек овса (ПОО) [3]. Данный вид сырья сохраняет продовольственную безопасность страны и характеризуется массовостью, доступностью, ежегодной возобновляемостью и низкой себестоимостью. Ранее нашим коллективом плодовые оболочки овса использовались в качестве сырья для получения биоэтанола [4], кормового белка [5], нитратов целлюлозы [6].

В данной работе рассматриваются проблемы получения питательной среды методом ферментативного гидролиза, в качестве субстрата для которого используется продукт азотнокислой обработки (ПАО) ПОО. Предварительная обработка сырья в одну стадию разбавленным раствором азотной кислоты позволяет достичь высоких результатов, поскольку химическое воздействие сочетает три функции: гидролиза, нитрования и окисления. Этот способ многократно апробирован в условиях опытно-промышленного производства ИПХЭТ СО РАН. Ферментативный гидролиз полученных субстратов осуществляется промышленно доступными ферментными препаратами. Успешность проведения ферментативного гидролиза в производственных условиях не является очевидной. Это связано с необходимостью тщательной промывки субстратов от ингибиторов [7] на стадии предварительной химической обработки, а также с сохранением микробиологической чистоты биотехнологических процессов, проводимых в емкостном оборудовании.

Следует отметить, что процесс получения питательной среды характеризуется сложностью масштабирования, как на этапе предварительной обработки сырья [8], так и на этапе ферментативного гидролиза [9]. В Комплексной программе развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 г. № 1853п-П8 от 24 апреля 2012 г. обращается внимание на то, что в России полностью отсутствует система «масштабирования» научных биотехнологических разработок для целей промышленного производства и другие элементы биоэкономики, необходимые для преобразования научных знаний в коммерческие продукты. Таким образом, исследования возможности получения питательной среды в производственных условиях для биосинтеза БЦ являются актуальными.

Целью данной работы являлось исследование преодоления проблем получения питательной среды в производственных условиях из плодовых оболочек овса для биосинтеза бактериальной целлюлозы.

Материалы и методы исследования

Определение основных характеристик сырья до и после предварительной химической обработки (массовые доли (м.д.) целлюлозы по Кюршнеру, пентозанов, кислотонерастворимого лигнина, золы) проводилось по стандартным методикам [10]. Наработка субстратов проводилась на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН согласно действующей нормативной документации.

Одностадийная обработка плодовых оболочек овса проводилась 4 %-ным раствором азотной кислоты при атмосферном давлении, температуре 90–96 °С в течение 4 ч, в результате был получен продукт азотнокислой обработки (ПАО) [4].

После азотнокислой обработки субстрат был промыт до нейтральной реакции и отжат на фильтр-прессе. Ферментативный гидролиз проводился в ацетатном буфере и водной среде в колбах Эрленмейера емкостью 0,5 л при концентрации субстрата 33,3 г/л, в водной среде при концентрации субстрата 60,0 г/л в трех вариантах: в колбах Эрленмейера емкостью 1 л, ферментере объемом 11 л и емкостном оборудовании объемом 63 л. Процесс ферментативного гидролиза проводился при непрерывном перемешивании с частотой колебаний 150 мин-1 в шейкере-инкубаторе «Unimax 1010». В работе использовались промышленно доступные ферментные препараты «Целлолюкс-А» (производитель ПО «Сиббиофарм», Бердск) и «Брюзайм BGX» (производитель «Polfa Tarchomin Pharmaceutical Works S.A.», Польша, для компании «Diadic International Inc.», США). Препарат «Целлолюкс-А» позиционируется на рынке как целлюлаза для расщепления некрахмалистых полисахаридов, «Брюзайм BGX» – как гемицеллюлаза. Температура ферментативного гидролиза составила 46–47 °С. Продолжительность ферментативного гидролиза составила 24 ч, при этом активная кислотность поддерживалась вручную на уровне 4,7–4,9.

Концентрация редуцирующих веществ (РВ) в пересчете на глюкозу определялась спектрофотометрическим методом с помощью реактива на основе 3,5-динитросалициловой кислоты на «UNICO UV-2804». Выход редуцирующих веществ (РВ) от массы субстрата рассчитан с учетом коэффициента 0,9, обусловленного присоединением молекулы воды к ангидроглюкозным остаткам соответствующих мономерных звеньев в результате ферментативного гидролиза.

Результаты исследования и их обсуждение

Химический состав сырья до и после обработки представлен в табл. 1.

Одностадийная обработка сырья раствором азотной кислоты приводит к следующим изменениям по сравнению с нативным сырьем: повышению массовой доли целлюлозы от (44,7 ± 0,2) % до (79,2 ± 0,3) %, снижению массовой доли пентозанов с (30,8 ± 0,2) % до (9,2 ± 0,2) % и уменьшению массовой доли кислотонерастворимого лигнина с (18,1 ± 0,1) % до (13,8 ± 0,1) %, при этом повысилась зольность. Продукт азотнокислой обработки ПОО представляет собой многокомпонентную смесь, включающую различные примеси, в том числе растворимые в осахаренном субстрате продукты окислительного нитрования лигнина. Однако достаточно высокая сумма гидролизуемых компонентов позволяет предположить высокую реакционную способность субстрата к ферментативному гидролизу и успешность дальнейшего синтеза бактериальной целлюлозы.

Работы по исследованию ферментативного гидролиза в ацетатном буфере ПАО ПОО [11] позволили сделать оптимистический прогноз относительно возможности получения питательной среды в производственных условиях для биосинтеза бактериальной целлюлозы – для начальной концентрации ПАО ПОО 33,3 г/л выход РВ составил 91,4 % от массы субстрата.

Таблица 1

Химический состав сырья до и после предварительной химической обработки

Наименование

Массовая доля, %

Сумма гидролизуемых компонентов, %

целлюлозы

пентозанов

лигнина

золы

Плодовые оболочки овса

44,7 ± 0,2

30,8 ± 0,2

18,1 ± 0,1

4,6 ± 0,1

75,5 ± 0,3

Продукт азотнокислой обработки

79,2 ± 0,3

9,2 ± 0,2

13,8 ± 0,1

8,2 ± 0,1

88,4 ± 0,3

Таблица 2

Результаты проведения ферментативного гидролиза в лабораторных условиях (колбах Эйленмейера) в ацетатном буфере и водной среде, а также при масштабировании процесса в ферментере и в производственных условиях (емкостном оборудовании)

Показатель

Колба,

объем

0,5 л

Колба, объем

0,5 л

Колба, объем 1 л

Ферментер, объем 11 л

Емкостное оборудование, объем 63 л

Среда для ферментативного гидролиза

ацетатный буфер [11]

водная среда

Начальная концентрация субстрата, г/л

33,3

60,0

Концентрация РВ, г/л

33,8 ± 0,2

32,3 ± 0,2

48,8 ± 0,2

42,8 ± 0,2

44,0 ± 0,2

Выход РВ, % от массы субстрата

91,4 ± 0,3

87,3 ± 0,3

73,3 ± 0,3

64,3 ± 0,2

66,0 ± 0,2

Опыты по исследованию ферментативного гидролиза были проведены поэтапно. Результаты проведения ферментативного гидролиза в лабораторных условиях (колбах Эйленмейера) в ацетатном буфере и водной среде, а также при масштабировании процесса в ферментере и в производственных условиях (емкостном оборудовании) отражены в табл. 2 и на рисунке.

Результаты, полученные в лабораторных условиях, а также при дальнейшем масштабировании процесса в ферментере и в емкостном оборудовании, демонстрируют схожий характер кривой зависимости концентрации РВ от продолжительности процесса ферментативного гидролиза (рисунок). Кривые накопления концентрации РВ показывают, что концентрация РВ увеличивалась экспоненциально и через 24 ч от начала ферментативного гидролиза достигла значений от (32,3 ± 0,2) г/л до (48,8 ± 0,2) г/л.

Концентрация РВ, полученная в результате ферментативного гидролиза в ацетатном буфере и водной среде (колбы объемом 0,5 л), практически совпадает и равна (33,8 ± 0,2) г/л и (32,3 ± 0,2) г/л соответственно. Это связано с тем, что проведение ферментативного гидролиза в водной среде в небольших объемах не осложнено трудностями корректировки активной кислотности, по сравнению с осуществлением процесса в емкостном оборудовании.

При получении питательной среды в емкостном оборудовании концентрация РВ снижается на 4,8 г/л по сравнению с результатами, полученными в колбе Эйленмейера (объем 1 л) и на 2,8 г/л по сравнению с ферментером. Это объясняется не только колебаниями активной кислотности в процессе ферментативного гидролиза, но и с недостаточной промывкой продукта азотнокислой обработки ПОО от ингибиторов на стадии предварительной химической обработки сырья, а также снижением активной кислотности в процессе ферментативного гидролиза и сложностью ее корректировки в производственных условиях вручную.

Проведение ферментативного гидролиза в ацетатном буфере при начальной концентрации субстрата 33,3 г/л (колба Эйленмейера, объем 0,5 л) позволяет достичь максимального выхода РВ от массы субстрата – (91,4 ± 0,3) %. Переход от ацетатного буфера при ферментативном гидролизе к водной среде является важным этапом для дальнейшего биосинтеза бактериальной целлюлозы, так как ацетатный буфер может оказывать ингибирующее действие на уксуснокислые бактерии и биосинтез бактериальной целлюлозы из-за избытка ацетат-ионов. Однако осуществить ферментативный гидролиз в водной среде сложнее по сравнению с ацетатным буфером, так как в процессе гидролиза снижается активная кислотность среды, что негативно влияет на биохимическую стабильность ферментных препаратов.

При ферментативном гидролизе в водной среде в колбе при начальной концентрации субстрата 33,3 г/л выход РВ снижается на 4,1 % и составляет (87,3 ± 0,3) % от массы субстрата, что связано с колебаниями активной кислотности при проведении процесса, так как в процессе ферментативного гидролиза наблюдается подкисление, а поскольку рН поддерживался на заданном уровне вручную, то периодически рН отклонялся.

baib1.wmf

Зависимость концентрации РВ от продолжительности процесса ферментативного гидролиза в ацетатном буфере и водной среде

При дальнейшем увеличении объема ферментативного водного гидролизата и начальной концентрации субстрата до 60 г/л, происходило еще большее снижение выхода РВ: в колбе объемом 1 л выход РВ составил (73,3 ± 0,3) % от массы субстрата, а при переходе к ферментеру объемом 11 л выход снизился еще на 9 % и составил (64,3 ± 0,2) % от массы субстрата. Таким образом, переход от ацетатного буфера к водной среде и дальнейшее масштабирование процесса ферментативного гидролиза по объему при одновременном повышении концентрации субстрата является сложной проблемой, требующей постоянного контроля активной кислотности на протяжении всего процесса. В связи с этим при переходе в производственные условия для реализации ферментативного гидролиза ПАО ПОО в емкостном оборудовании объемом 63 л было принято решение о ежечасном контроле и корректировке активной кислотности. Это позволило достичь положительных результатов – в емкостном оборудовании был получен выход РВ (66,0 ± 0,2) % от массы субстрата.

Выполненные исследования свидетельствуют о том, что для получения питательной среды в производственных условиях для последующего биосинтеза бактериальной целлюлозы возможно применение одностадийной химической обработки сырья раствором азотной кислоты.

В работе [12] показано, что максимальный выход БЦ (8,7–9,0 %) обеспечивается при начальной концентрации глюкозы в среде 20–25 г/л. Таким образом, можно сделать вывод, что полученная ферментативным способом в производственных условиях питательная среда с концентрацией РВ (44,0 ± 0,2) г/л из сельскохозяйственных отходов – плодовых оболочек овса, предварительно обработанных разбавленным раствором азотной кислоты, может быть пригодна для дальнейшего биосинтеза бактериальной целлюлозы.

Выводы

Исследована возможность получения питательной среды в производственных условиях ферментативным способом из продукта азотнокислой обработки плодовых оболочек овса в водной среде для биосинтеза бактериальной целлюлозы. По результатам работы выявлено, что при переходе от ацетатного буфера к водной среде в процессе ферментативного гидролиза при начальной концентрации субстрата 33,3 г/л наблюдается снижение концентрации редуцирующих веществ от (33,8 ± 0,2) г/л до (32,3 ± 0,2) г/л или на 4,1 % в пересчете на выход РВ от массы субстрата. Показано, что при поэтапном масштабировании ферментативного гидролиза по объему в водной среде при начальной концентрации субстрата 60,0 г/л происходит снижение выхода РВ: в колбе объемом 1 л выход РВ составил (73,3 ± 0,3) % от массы субстрата, а при переходе к ферментеру объемом 11 л выход снизился еще на 9 % и составил (64,3 ± 0,2) % от массы субстрата. Постоянный контроль и корректировка активной кислотности в емкостном оборудовании позволили получить выход РВ (66,0 ± 0,2) % от массы субстрата. Таким образом, установлено, что ферментативным гидролизом в водной среде при использовании ферментных препаратов Целлолюкс-А и Брюзайм BGX в производственных условиях можно получить питательную среду для последующего биосинтеза бактериальной целлюлозы из плодовых оболочек овса одностадийно обработанных раствором азотной кислоты.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 17-19-01054).


Библиографическая ссылка

Байбакова О.В. ПРОБЛЕМЫ МАСШТАБИРОВАНИЯ В ВОДНОЙ СРЕДЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ПРОДУКТА АЗОТНОКИСЛОЙ ОБРАБОТКИ ПЛОДОВЫХ ОБОЛОЧЕК ОВСА – ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ БИОСИНТЕЗА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ // Фундаментальные исследования. – 2017. – № 9-2. – С. 261-265;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=41737 (дата обращения: 29.09.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074