Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ЛЕНГМЮРА-БЛОДЖЕТТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛЕНОК С ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Разумникова И.С. 1 Бабич О.О. 1 Солдатова Л.С. 1
1 ООО «Инновационно-исследовательский центр»
Оптимизированы параметры получения монослоев с однонаправлено выровненными a-спиралями с содержанием стерильного компонента 30 мол. %. Устойчивые, трансферабельные монослои были получены с отношением переходов около единицы во всем диапазоне поверхностных давлений. При рН суб-фазы 8,6 протяженная связь С=О водородной связи карбоксильной группы при 1711 см-1 исчезает, и появляется полоса ионизованной карбоксильной группы при 1560 см-1, свидетельствуя о том, что происходят изменения α-структуры. Спектры монослоев, приготовленных на чистой воде при рН субфазы 2, идентичны друг другу, проявляя характеристические полосы амида I и амида II при 1653 см-1 и 1548 см-1. Методом атомной силовой микроскопии показано, что получены гомогенные и однородные пленки Лэн-гмюра-Блоджетт. Показано, что осмотическое давление внутри пленок может увеличивать стабильность α-спиральной структуры.
квазиодномерные комплексы
метод Лэнгмюра-Блоджетт
био- и иммуносенсоры
биологически активные соединения
физические и химические воздействия
ИК-спектр
полимеризация
a-спиральный диблок

Разработка экспрессных, точных и чувствительных вариантов определения биологически активных соединений - одна из актуальных задач современной аналитической химии. Исследования в этой области стимулируются потребностями медицины, пищевой промышленности, ветеринарии, необходимостью мониторинга окружающей среды [4].

Определение высоко- и низкомолекулярных биологически активных соединений представляет как практический, так и теоретический интерес для изучения их свойств, содержания в сыворотке крови и других матриксах, влияния на организм человека и животных, структуры синтезированных соединений и биохимических реакций с их участием. Биологически активные соединения, как и многие физиологически активные вещества, способны оказывать положительное или отрицательное воздействие на организм в зависимости от дозы и длительности воздействия. Кроме того, в связи с широким применением высокоэффективных биологически активных соединений в других областях жизнедеятельности (например, в сельском хозяйстве) в воде и пищевых продуктах могут содержаться остатки этих препаратов в количествах, превышающих безопасный уровень. В связи с требованиями повышения качества жизни и увеличением поступлений фальсифицированной продукции на фармацевтический рынок в последнее время необходимы разнообразные варианты количественного определения широкого круга биологически активных соединений для оценки их качества, а также для определения их содержания в организме человека и животных [5, 6].

Новейшие достижения в области создания био- и иммуносенсоров связаны с разработкой и получением новых функциональных материалов для физического трансдьюсера. Развиваются методы хемо- и биоселективного распознавания и связывания, а также эффективные методы микро- и наноструктурирования. Для электрохимических детекторов перспективным материалом являются тонкие пленки [1].

Среди тонких пленок в настоящее время особый интерес проявляется к проводящим пленкам Ленгмюра-Блоджетт на основе ква­зи­одномерных комплексов с переносом заряда. Высокая проводимость пленок Ленгмюра-Блоджетт - необходимое условие их использования в качестве материалов в тон­ко­пле­ноч­ных структурах биосенсорных устройств [2, 3].

В связи со всем вышесказанным настоящие исследования направлены на конструирование полипептидных монослоев с ориентированными α-спиралями, главным образом, с применением поверхностной графт-сополимеризации и техники Ленгмюра-Блоджетт. Метод Ленгмюра-Блоджетт позволяет получать монослой молекул на поверхности раздела фаз воздух-жидкость и жидкость-жидкость перед переходом на твердый субстрат.

При выполнении работы использовали общепринятые, стандартные и оригинальные методы исследования биохимического и физико-химического анализа с использованием последних достижений науки и техники. Учет и обработку результатов проводили методами статистического и регрессионного анализа.

Материалы и методы исследования

Термогравиметрический анализ. Термогравиметрический анализ проводили с использованием термогравиметрического анализатора Перкина-Эльмера при скорости нагревания 10°С/мин в атмосфере азота. Соотношение длин блоков (tBuLG)m-b-(MLGSLG)n определяется по формуле:

с потерями массы на первом этапе WL, вызванных выделением изобутилена, начинающихся при 180°С и заканчивающихся при 250°С.

Элементный анализ. Элементный анализ осуществляли на анализаторе HEKAtech Gmbh Euro-EA CHN. Соотношение длин блоков сополимера можно рассчитать по формуле:

(1): (tBuLG)m-b-(MLGSLG)n, (2): (LGA)m-b-(MLGSLG)n - после удаления трет-бутильной защитной группы TFA.ИК-спектроскопия нарушенного полного внутреннего отражения с Фурье-преобразованием. ИК-спектроскопию нарушенного полного внутреннего отражения с Фурье-преобразованием осуществляли на спектрофотометре Bruker IFS88 FT-IR при разрешении 4 см-1.

ИК-Фурье спектроскопия. ИК-Фурье спектроскопию на двусторонних полированных силиконовых субстратах осуществляли при разрешении 3 см-1 под вакуумом на спектрофотометре Bruker IFS66 V/S FT-IR.Результаты исследования и их обсуждение

В настоящем исследовании ставилась цель получить монослои с однонаправленно выровненными a-спиралями поли(γ-метил-L-глутамат-транс-γ-стерил-L-глутамата) с содержанием стерильного компонента 30 мол.% (ПMLГСLГ). Гидрофобное соединение ПMLГСLГ с жесткой структурой позволяет получить прочные пленки Ленгмюра-Блоджетт с высоко ориентированными a-спиралями, расположенными параллельно субстрату, с гибкими стерил-цепочками. Полиглутаматы проявляют лиотропные и термотропные свойства и получили широкое распространение в последние годы.

На рис. 1 представлены π-А-изотермы для (LГК)63-β-(MLГСLГ)39 и (LГК)59-β (MLГСLГ)82, находящихся на поверхности воды при 20°С, в сравнении с изотермами для ПLГК и ПMLГСLГ. Изотерма ПLГК, находящейся на поверхности чистой воды, похожа на изотерму, опубликованную для натриевой соли ПLГК при рН 3,0. ПLГК - это в некоторой степени активная поверхность, проявляющая переход при низком поверхностном давлении 5-7 мN/м. Как известно из литературных данных, изотерма ПMLГСLГ имеет крутой подъем давления вследствие упаковки a-спиралей на поверхности за счет жидко-конденсированной фазы. При последующем сжатии монослоя ПMLГСLГ наблюдается коллапс с переходом на плато при 33 мN/м. Изотермы диблок сополимеров ПLГК-β-ПMLГСLГ проявляют совершенно другое поведение. При сжатии сначала наблюдается переход, аналогичный изотерме ПLГК при тех же самых условиях детектирования, а затем происходит линейное увеличение поверхностного давления. Для (LГК)59-β (MLГСLГ)82 с более длинным гидрофобным блоком наблюдается другой переход выше 40 мN/м.

 

Рис. 1. π-А-изотерма (LГК)63-β-(MLГСLГ)39 (сплошная линия), (LГК)59-β (MLГСLГ)82 (сплющенная линия), (MLГСLГ)118 (пунктирная линия) и (LГК)63 (открытые циклы) на водной поверхности при 20°С

Первый переход при 5-10 мN/м относится к водной иммерсии блока ПLГК. Следовательно, варьирование рН субфазы может влиять на переход. При высоких значениях рН распространение спиральных конформационных изменений блока ПLГК приводит к ограничению поверхностного объема, вызванного расширением, что свидетельствует о низком поверхностном давлении даже при большом поверхностном объеме. При сжатии большое снижение поверхностного объема с небольшим увеличением поверхностного давления связано с поверхностной водной солюбилизацией блока ПLГК при высоких значениях рН.

На рис. 2 представлены кривые стабилизации (LГК)63-β-(MLГСLГ)39 и (LГК)59-β (MLГСLГ)82, полученные при различных величинах поверхностного давления. Устойчивые, трансферабельные монослои были получены с отношением переходов около единицы во всем диапазоне поверхностных давлений.

 

Рис. 2. а - кривые стабилизации (LГК)63-β-(MLГСLГ)39 при 6 (а), 9 (b), 20 (с), 40 (d) и 45 (е) мN/м; б - кривые стабилизации (LГК)59-β (MLГСLГ)82 при 20 (а), 35 (b) и 45 (с) мN/м

Как следует из точек стабилизации, представленных на рис. 2, площади, занимаемые молекулами, в которых монослои стабилизируются в соответствии с π-A-изотермой, что свидетельствует об отсутствии эффектов релаксации. Только выше второго перехода на изотерме, записанной для (LГК)59-β (MLГСLГ)82, т.е. при 45 мN/м, точка стабилизации сдвигается в область низких площадей. Это подразумевает, что переход, который может быть связан с перераспределениями цепей, является более медленным процессом. Хотя монослои стабилизируются при 45 мN/м, сдвиг пленки приводит к частичному переходу. Возможно, поэтому монослой в этом состоянии является неподвижным.

Результаты угловой микроскопии Брюстера получали в процессе сжатия-расширения на чистой водной поверхности при различных значениях рН субфазы (рис. 3-5). При распределении по чистой водной поверхности образуется монослойная область с водными промежутками. Давление уменьшает водные промежутки, и, как только возникает поверхностное давление, образуется гомогенный монослой. Для обоих ПLГК-β-ПMLГСLГ при величине давления 45-50 мN/м не зарегистрирован монослойный коллапс. При расширении монослой сначала разрушается, а затем возвращается в исходное состояние.

Сообщалось для поли (γ-бензил-L-глутамата) (ПБLГ) молекулы без внешнего давления агрегируются в 2D-островки толщиной в одну молекулу на водной поверхности. По сравнению с PBLG, на чистой водной поверхности (LГК)63-β-(MLГСLГ)39 образует намного более мелкие агрегаты (рис. 3). Это, вероятно, связано, с взаимодействиями между длинными гидрофильными блоками ПLГК и водной поверхностью, что ограничивает множественные антипараллельные связи между молекулами. Таким образом, при увеличении активной поверхности диблок сополимеров либо снижением рН субфазы, либо повышением DPPMLGSLG, образуется более агрегированный монослой (рис. 4 а, b, 5). Напротив, при высоком значении рН 8,6, когда ПLГК полностью заряжен, агрегации не наблюдается (рис. 4, с, d). Водная солюбилизация ПLГК при этом рН приводит к молекулярной реориентации, препятствуя антипараллельным ориентациям спиралей.

a                                                                       b

c                                                            d 

Рис. 3. Результаты угловой микроскопии Брюстера (420×522 мкм) (LГК)63-β-(MLГСLГ)39
при сжатии до 45 мN/м на чистой водной поверхности при 20°С, полученные при А = 32 (а) и 17 (b) нм2/молекула. При соответствующем расширении изображения получали при А = 17 (а) и 32 (b) нм2/молекула

a                                                       b

c                                                  d

Рис. 4. Результаты угловой микроскопии Брюстера (420×522 мкм) (LГК)63-β-(MLГСLГ)39
при сжатии до 45 мN/м на чистой водной поверхности при 20°С, рН субфазы 2, полученные при А = 32 (а) и 25 (b) нм2/молекула. При рН 8,6 изображения получены при А = 30 (а) и 12 (b) нм2/молекула во время сжатия

Методом атомной силовой микроскопии показано, что получены гомогенные и однородные пленки Ленгмюра-Блоджетт. На рис. 6 представлены типичные спектры, скорректированные с учетом линейного дихроизма, зарегистрированные в разных направлениях спектрополяриметра, для многослойных пленок Ленгмюра-Блоджетт ПLГК-β-ПMLГСLГ. Эффект Ленгмюра-Блоджетт вызван предпочтительной ориентацией α-спиралей вдоль поверхности погружения. Скорректированные спектры анализировали в различных направлениях, сопоставляя друг с другом. В результате показано, что наблюдается один максимум при 191 нм и два минимума при 208 и 222 нм. Это свидетельствует о том, что полученные пленки ПLГК-β-ПMLГСLГ имеют правостороннюю α-спиральную структуру.

a                                                             b

c                                                            d

Рис. 5. Результаты угловой микроскопии Брюстера (420×522 мкм) (LГК)59-β (MLГСLГ)82
при сжатии до 50 мN/м на чистой водной поверхности при 20°С, полученные при А = 39 (а) и 27 (b) и 23 (с) нм2/молекула. При соответствующем расширении изображения получали при А = 29 (d) нм2/молекула

a                                       b                                             c

Рис. 6. CD-спектры, LD- спектры и скорректированные CD-спектры многослойной пленки Лэнгмюра-Блоджетт (LГК)63-β-(MLГСLГ)39, записанные при 40 мN/м. Образец анализировался в двух разных направлениях: горизонтальном (сплошная линия) и вертикальном (пунктирная линия)

На рис. 7 представлены ИК-спектры монослоев Ленгмюра-Блоджетт (LГК)63-β-(MLГСLГ)39, полученные на чистой воде при различных значениях рН. При рН субфазы 8,6 протяженная связь С = О водородной связи карбоксильной группы при 1711 см-1 исчезает, и появляется полоса ионизованной карбоксильной группы при 1560 см-1, свидетельствуя о том, что происходят изменения α-структуры в блоке ПLГК. Спектры монослоев, приготовленных на чистой воде при рН субфазы 2, идентичны друг другу, проявляя характеристические полосы амида I и амида II при 1653 и 1548 см-1. Отсюда следует, что даже когда ПLГК-β-ПMLГСLГ расположен на поверхности чистой воды, преобладающей является α-структура.

 

Рис. 7. ИК-спектр монослоев Ленгмюра-Блоджетт (с обеих сторон силиконового субстрата) (LГК)63-β-(MLГСLГ)39, записанный при 40 мN/м

Известно, что ПLГК образует полностью α-спиральную структуру в водных растворах при рН ниже 5,0. Его переход между α-спиральной и случайной конформациями происходит в области рН от 5,0 до 6,0, где содержание α-структуры составляет 80-70%. Преобладающая α-спиральная структура монослоя ПLГК-β-ПMLГСLГ на поверхности чистой воды частично является следствием того, что поверхность воды имеет более кислое значение рН (около 5,5), увеличиваясь при повышении содержания атмосферного СО2, диссоциируемого в субфазе. Исследования α-спиральных переходов ПLГК в вод­ных растворах, содержащих осмолиты, показали увеличение осмотического давления с преобладанием α-спиральных форм.

Таким образом, осмотическое давление внутри ПLГК может увеличивать стабильность α-спиральной структуры.

Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007‒2013 годы» (государственный контракт №16.512.11.2220).

Рецензенты:

  • Просеков А.Ю., д.т.н, профессор, проректор по НИР ФГБОУ ВПО»Кемеровский технологический институт пищевой промышленности», г. Кемерово;
  • Майоров А.А., д.т.н., профессор, директор ГНУ СибНИИС СО Россельхозакадемии, г. Барнаул.

Работа поступила в редакцию 07.06.2012.


Библиографическая ссылка

Разумникова И.С., Бабич О.О., Солдатова Л.С. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ЛЕНГМЮРА-БЛОДЖЕТТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛЕНОК С ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 6-3. – С. 662-667;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30097 (дата обращения: 17.11.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074