В последнее десятилетие появляется все больше данных, подтверждающих возможность как позитивного, так и негативного эффектов стресса на защитные функции организма. Одним из основных механизмов развития дисфункций иммунной системы при тяжелом стрессе и ряде отягощенных стрессом заболеваний является нарушение взаимодействия нейроэндокринной и иммунной систем [3, 5, 9]. Выявление природы этих нарушений открывает новые возможности для адресного воздействия с целью их коррекции и, таким образом, лечения стресс-обусловленных заболеваний.

Потенциал защитных функций организма в значительной степени определяется уровнем активности клеток иммунной системы, включающим интенсивность пролиферации лимфоцитов при действии цитокина интерлейкина-1b (ИЛ-1b) и уровень цитотоксической активности естественных киллерных (ЕК) клеток, являющихся первым барьером на пути развития инфекционных и онкологических заболеваний [4, 8].

Анализ функциональных резервов иммунокомпетентных клеток в совокупности с другими показателями активности защитных функций, таких как активность гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной (ГГАКС) и гипоталамо-гипофизарно-гонодальной (ГГГС) систем организма, позволяет раскрыть механизмы их нарушений при различных дестабилизирующих воздействиях, в том числе при стрессе. Изменение концентраций в крови кортикостерона и тестостерона - гормонов, отражающих активность ГГАКС и ГГГС, соответственно - рационально также использовать в качестве показателей стрессорной реакции.

Одним из потенциальных корректоров нарушенных защитных функций является лекарственный препарат Деринат (АО ФП «Техномедсервис», Москва) - натриевая соль нативной ДНК с молекулярной массой 270-500 kDa, получаемая из молок лососевых или осетровых рыб, обладающая радиопротекторной, противовирусной, регенеративной активностью [1, 2].

Целью работы явилось исследование изменения цитотоксической и пролиферативной активности спленоцитов, концентрации глюкокортикоидных гормонов и тестостерона в крови крыс, подвергнутых действию холодового стресса в различных режимах, а также определение способа их коррекции с помощью препарата Деринат.

Эксперименты выполнены на 89 крысах-самцах Wistar массой 200-220 г. Деринат, растворенный в 0,15 М NaCl, вводили животным однокpатно, в/бр в дозе 10 мг/кг массы.

В работе использованы две модели экспериментального стресса: холодовой стресс (охлаждение крыс в индивидуальных металлических контейнерах в течение 10 мин при -20 °С) и комбинированный стресс (охлаждение животных, фиксированных на спине, в течение 30 мин при -20 °С).

Экспериментальные группы животных:

1. Интактные животные, находящиеся в условиях стандартного содержания.
2. Контрольные животные, которым в/бр вводили pаствоp 0,15 М NaCl.
3. Животные, которым в/бр вводили Деринат в дозе 10 мг/кг массы.
4. Животные, подвергнутые стрессорному воздействию через 20 мин после однокpатной в/бр иньекции раствора 0,15 М NaCl.
5. Животные, подвергнутые стрессорному воздействию через 20 мин после однократной в/бр инъекции Дерината в дозе 10 мг/кг массы.

При оценке цитотоксической активности ЕK клеток селезенки в качестве мишеней для них использовали клетки эритромиелолейкоза человека К-562 (Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург), которые метили ³Н-уридином («Изотоп», Россия). Реакцию между клетками-эффекторами и клетками-мишенями учитывали по уровню ³Н-уридина в нелизированных клетках-мишенях в течение 1 мин (c.p.m.) при использовании β-счетчика (Beckman).

Определение интенсивности реакции бласттрансформации спленоцитов (РБТС) осуществляли общепринятым методом [8] при внесении в суспензию клеток Кон А (Sigma, 0,75 мкг/мл) и рекомбинантного ИЛ-1β (Sigma) со специфической активностью 1,0∙10⁷ ед/мг белка в дозе 250 нг/мл. Оценку включения H³-тимидин в ДНК делящихся клеток проводили на β-счетчике.

Концентрацию кортикостерона и тестостерона в крови определяли иммуноферментным методом с использованием реактивов Хема-Медика (РФ).

Статистическая обработка результатов проведена по критерию t Стьюдента.

Через 1 ч после окончания 10-минутного холодового стресса в крови крыс наблюдалось увеличение концентрации кортикостерона и снижение уровня тестостерона по сравнению с этим показателем у нестрессированных животных. Более интенсивное комбинированное 30-минутное воздействие также приводило к повышению уровня кортикостерона в крови через 1 ч с последующим возвращением к нормальным значениям через 24 ч и снижению концентрации тестостерона в оба регистрируемых срока (табл. 1). Полученные данные демонстрируют развертывание стрессорной реакции у животных при обоих видах воздействия.

Примечания:

* - р < 0,05 по сравнению с показателями в контрольной группе животных;

^ - р < 0,05 по сравнению с этим же показателем у интактных животных.

Введение Дерината нестрессированным крысам в дозе 10 мг/кг массы вызывало повышение концентрации кортикостерона и тестостерона через 1 ч, а кортикостерона также и через 24 ч после введения препарата по сравнению с этими показателями у контрольных животных (см. табл. 1).

У животных, которым до аппликации обоих видов стресса вводили Деринат, не наблюдалось изменения концентрации кортикостерона в крови по сравнению с тем же показателем у стрессированных животных, которым вводили 0,15 М NaCl (за исключением повышения уровня гормона через 1 ч после окончания 10-минутного холодового воздействия). В отличие от кортикостерона, концентрация тестостерона в крови крыс увеличивалась, если до аппликации стресса животным вводили Деринат (см. табл. 1). Таким образом, введение Дерината предотвращало стресс-индуцированное снижение концентрации тестостерона в крови, оказывая стресс-протективное действие.

Спленоциты интактных и контрольных животных оказывали цитотоксическое действие на клетки опухолевой линии К-562, которое было наиболее выражено при соотношении клетки-эффекторы:клетки-мишени = 25:1 (табл. 2). Введение Дерината в дозе 10 мг/кг массы крысы через 24 ч вызывало увеличение цитотоксической активности ЕK клеток по сравнению с тем же показателем у контрольных животных (см. табл. 2).

Примечания:

* - р < 0,05 по сравнению с показателями в контрольной группе животных;

# - р < 0,05 по сравнению с показателями в группе животных после 30-минутного стресса (Контрольные + стресс 30 мин).

Использованные в работе модели экспериментального стресса по-разному изменяли цитотоксичность спленоцитов крыс. Относительно мягкое, 10-минутное охлаждение животных без дополнительной их иммобилизации приводило к стимуляции цитотоксической активности спленоцитов через 24 ч после окончания воздействия, а введение Дерината до аппликации стресса препятствовало этому увеличению (см. табл. 2).

Интенсивное 30-минутное комбинированное воздействие приводило к угнетению цитотоксической активности спленоцитов через 24 ч после окончания действия стресса. Введение Дерината за 20 мин до этого воздействия предотвращало снижение специфической цитотоксичности ЕК клеток, восстанавливая ее до 95-123 % от уровня активности клеток интактных животных (см. табл. 2). Таким образом, введение Дерината в дозе 10 мг/мл оказывало выраженное протективное действие на функциональную активность ЕK клеток селезенки, измененную в результате холодовых стрессорных воздействий в различных режимах.

Введение Дерината интактным и контрольным животным вызывало увеличение скорости включения ³H-тимидина в ДНК делящихся спленоцитов в результате комитогенного действия ИЛ-1β в присутствии Кoн А (см. табл. 2). Установлено, что 10-минутное охлаждение вызывает интенсификацию РБТС при инкубации клеток с Кон А, а также Кон А совместно с ИЛ-1β через 24 ч после окончания стрессорного воздействия по сравнению с уровнем этой реакции у интактных животных (см. табл. 2). Введение Дерината за 20 мин до аппликации 10-минутного стресса не приводило к изменению интенсивности РБТС (см. табл. 2). Комбинированное 30-минутное воздействие на крыс через 24 ч после его окончания вызывало снижение уровня РБТС. Инъекция Дерината до аппликации 30-минутного стресса через 24 ч восстанавливала интенсивность включения метки в нестимулированные лимфобласты, а также при их стимуляции Кон А и ИЛ-1β (см. табл. 2). Таким образом, введение Дерината приводило к усилению реакции спленоцитов крыс, подвергнутых 30-минутному комбинированному воздействию, на комитогенное действие ИЛ-1β и, следовательно, препятствовало стресс-индуцированному угнетению пролиферативной активности клеток.

Результаты исследований позволяют заключить, что стресс-обусловленные изменения функциональной активности иммунокомпетентных клеток зависят от интенсивности стрессорного воздействия: 10-минутное охлаждение крыс приводит к стимуляции специфической цитотоксичности и пролиферативной активности спленоцитов в ответ на комитогенное действие ИЛ-1β через 24 ч после окончания стрессорного воздействия, а интенсивное 30-минутное холодовое воздействие в сочетании с иммобилизацией животных вызывает снижение этих показателей. Изменение уровня гормонов в крови, наоборот, не зависит от вида воздействия: на обеих моделях стресса показано повышение уровня кортикостерона и снижение концентрации тестостерона в крови животных. Полученные результаты соответствуют данным литературы о контрфазном характере изменения содержания этих гормонов в крови при стрессе: повышение концентрации кортикостерона сопровождается снижением уровня тестостерона, которые реализуются на уровне гипофиза и имеют адаптивное значение [10].

При аппликации стресса на фоне введения препарата нативной ДНК Деринат установлено его стресс-протективное действие, проявляющееся в предотвращении снижения концентрации тестостерона в крови.

После введения Дерината в дозе 10 мг/кг цитотоксическая активность ЕК клеток селезенки, повышенная в условиях кратковременного стрессорного воздействия, снижается практически до нормы, а в случае ее угнетения, вызванного жестким комбинированным стрессом, она восстанавливается также до нормальных значений. Введение Дерината препятствует стресс-индуцированному угнетению пролиферативной активности спленоцитов, вызывая нормализацию реакции клеток на комитогенное действие ИЛ-1β. Таким образом, Деринат, расщепляющийся в клетках организма до нуклеотидов, которые после выделения во внеклеточную среду связываются с пуринергическими Р2 рецепторами [6, 7], обладает не только стресс-протективными эффектами, но и оказывает нормализующее действие на стресс-индуцированные изменения некоторых функций иммунной системы.

Полученные экспериментальные данные согласуются с результатами клинических наблюдений [1, 2], в которых показано корригирующее влияние препаратов нуклеотидной природы при нарушениях, обусловленных как ослаблением функций иммунной системы, так и избыточной их активностью.

• Дыбан П.А., д.м.н., ведущий научный сотрудник отдела молекулярной генетики НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург;
• Кокряков В.Н., д.б.н., профессор кафедры биохимии Санкт-Петербургского государственного университета, г. Санкт-Петербург.

Работа поступила в редакцию 09.12.2011.