Хорошо известно, что практически все ферменты, в частности внутриклеточные, никогда не функционируют в условиях, отвечающих классической кинетике Михаэлиса-Ментен, так как они находятся в сложной гетерогенной системе клетки. Сегодня доказано, что ферменты большинства метаболических путей связаны с теми или иными мембранными структурами клетки. При этом ферменты, действующие в гетерогенном окружении, приобретают новые свойства, которые отсутствуют у тех же ферментов, когда они находятся в разбавленном растворе [4].

Одной из наиболее изученных клеточных моделей, в состав которой входят различные мультиэнзимные комплексы, является эритроцит. Данная клетка чрезвычайно интересна тем, что в ее ферментативном ансамбле присутствуют ферменты биотрансформации ксенобиотиков. Одним из таковых является альдегиддегидрогеназа (КФ 1.2.1.3., АлДГ). Особенности регуляции АлДГ эритроцита до сих пор в научной литературе представлены крайне фрагментарно, особенно это касается различных молекулярных форм фермента [5, 6, 7, 8]. Остается невыясненной физиологическая роль взаимодействия АлДГ с мембраной эритроцитов.

Целью данной работы явилось выявление топохимии надмолекулярных форм альдегиддегидрогеназы эритроцитов крови человека.

Кровь для исследования брали у практически здоровых людей из локтевой вены с 4%-м раствором цитрата натрия (соотношение 9:1) с соблюдением всех необходимых правил в условиях медицинского стационара. Эритроциты осаждали (800g; 10 мин), промывали 5-кратным объемом 0,15М NaCl с 10мМ трис-НСl (рН 7,4), гемолизировали, через 30 мин центрифугировали (16000g; 10 мин) [3]. Активность АлДГ определяли в «тенях» эритроцитов и супернатанте [2]. Солюбилизацию эритроцитарной АлДГ проводили путем однократного суспендирования «теней» эритроцитов в 0,15 М и 0,3 М растворах КСl. Определяли следующие кинетические характеристики альдегиддегидрогеназы: K_t, V_max, V_max/K_t (К_a) [1], где K_t - время достижения V_max ферментативной реакции (мин); V_max - максимальная скорость накопления продукта реакции при полном расходовании субстрата (мкмоль/мин); V_max/K_t (К_a) - коэффициент каталитической эффективности ферментативной реакции (мкмоль/мин²) [1]. Статистический анализ результатов исследований выполнен с использованием программы Statistica 6.

Проведенные исследования показали, что активность фермента в «тенях» эритроцитов, которые представляют мембрану данных клеток, составила 51,3% от общей активности АлДГ в гемолизате клеток, а в матриксе эритроцитов - 45,2% (табл. 1).

Распределение активности альдегиддегидрогеназы во фракциях эритроцитов крови человека (нмольНАДН/мин×мг белка)

Учитывая, что активность альдегиддегидрогеназы во фракции «теней» эритроцитов выше, чем в матриксе, можно полагать, что АлДГ - преимущественно мембранносвязанный фермент. Поэтому дальнейшие эксперименты с мембранной формой альдегиддегидрогеназы были посвящены определению прочности связи фермента с мембраной эритроцита.

Однократное воздействие на фрагменты мембран эритроцитов 0,15М раствором КСl приводит к статистически значимому снижению активности альдегиддегидрогеназы в «тенях» данных клеток на 39,5%, а также увеличению активности фермента на 53,3% в супернатанте, полученном после центрифугирования (табл. 2).

Однократная солюбилизация мембраносвязанной альдегиддегидрогеназы эритроцитов 0,3М раствором КСl вызывает статистически значимое увеличение активности АлДГ в супернатанте на 65,5% и уменьшение в «тенях» эритроцитов на 49,1% (см. табл. 2).

Полученные результаты исследования позволяют предположить, что альдегиддегидрогеназа находится в эритроцитах, как минимум в трех основных надмолекулярных формах (матриксная форма, лабильно связанная с мембраной форма АлДГ и прочносвязанная с мембраной эритроцитов форма фермента).

В табл. 3 представлена кинетическая характеристика альдегиддегидрогеназы различных фракций эритроцита.

Активность альдегиддегидрогеназы после солюбилизации с мембраны эритроцитов под влиянием 0,15М и 0,3М KCl (нмольНАДН/мин∙мг белка)

Кинетическая характеристика альдегиддегидрогеназы различных фракций эритроцитов крови человека (K_t, V_max, K_a)

Видно, что сродство к субстратам реакции (K_t) и коэффициент каталитической эффективности (K_a) мембранносвязанной АлДГ («тени» эритроцитов) выше, чем у альдегиддегидрогеназы в матриксе и гемолизате эритроцитов.

Использование KCl для солюбилизации АлДГ с мембраны эритроцитов позволило выявить определенную закономерность в изменении кинетической характеристики данного фермента. В частности, по мере удаления части АлДГ с мембраны эритроцитов, сродство фермента к субстратам реакции возрастает (табл. 4). При этом в супернатанте значение K_t, наоборот, возрастает.

Предполагается, что мембранная форма АлДГ неоднородна и представлена, как минимум, двумя формами фермента: лабильно- и прочносвязанной, на что указывают данные по солюбилизации КСl (0,15М и 0,3М) (см. табл. 4).

Кинетические характеристики альдегиддегидрогеназы после солюбилизации с мембраны эритроцитов под влиянием 0,15М и 0,3М KCl (K_t, V_max, K_a)

Таким образом, можно полагать, что альдегиддегидрогеназа, вернее, ее различные надмолекулярные формы, имеют определенную топохимическую организацию в эритроцитах крови человека, что играет определяющее значение для регуляции данного фермента биотрансформации в клетке.

• Веселов А.П., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биохимии и физиологии растений, декан биологического факультета ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород;
• Корягин А.С., д.б.н., профессор кафедры физиологии и биохимии человека и животных ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород.

Работа поступила в редакцию 09.04.2012