Систематическое употребление этанола, даже в малых дозах, является предпосылкой возникновения и прогрессирования заболеваний многих внутренних органов. Многочисленными исследованиями показаны метаболические, гормональные, нейромедиаторные и иммунные нарушения под влиянием хронической алкогольной интоксикации [1, 7, 15]. В условиях длительной алкоголизации этанол может повреждать любые органы и ткани из-за его мембранотропности и способности изменять ключевые звенья клеточного метаболизма, что приводит к повышенной гибели различных клеток [11, 12]. Кроме того, на всех этапах метаболизма этанола образуются активные формы кислорода (АФК), избыточное накопление которых может быть причиной повреждения и гибели клетки [11].

Убедительные данные о том, что хроническое поступление алкоголя в организм приводит к состоянию окислительного стресса и клеточной гибели во многих органах и системах, позволяют сделать заключение, что использование биорегулирующих средств в комплексных программах терапии больных алкоголизмом является перспективным. Наиболее подходящими в данном направлении могут быть биорегулирующие низкомолекулярные соединения, способные понижать уровень радикалов и проникающие через гематоэнцефалический барьер. Нейрометаболический протектор кортексин относится к классу цитомединов и представляет собой комплекс L-аминокислот и полипептидов. Препарат обладает тканеспецифическим действием на кору головного мозга, оказывает ноотропное и противосудорожное действие, улучшает процессы обучения и памяти, снижает токсические эффекты нейротропных веществ, стимулирует репаративные функции и ускоряет восстановление головного мозга после стрессорных воздействий, регулирует процессы метаболизма нейромедиаторов и перекисного окисления в коре головного мозга, препятствует образованию избыточного количества свободных радикалов [6, 10]. В последние годы препарат успешно применяется в терапии аддиктивных расстройств и приводит к снижению уровня невротизации и тревоги, улучшению клинической симптоматики пациентов, снижению уровня окислительного стресса у больных алкоголизмом [2, 4]. В то же время остаются недостаточно изучены механизмы действия препарата и его протективное влияние на клетки в условиях окислительного стресса и экспериментального воздействия этанола. Изучение запрограммированной клеточной гибели в культуре клеток несет важную биологическую информацию и является целесообразным для патогенетического обоснования применения препарата в терапии аддиктивных расстройств.

Целью настоящей работы явилось изу­чение влияния препарата кортексин на процессы апоптоза лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, культивированных in vitro в условиях индуцированного окислительного стресса и под влиянием этанола.

Материалы и методы исследования

В качестве экспериментального материала использованы лимфоциты периферической крови 6 психически и соматически здоровых лиц. Отбор здоровых лиц проводили, используя углубленный опрос с помощью специальной анкеты, разработанной в лаборатории клеточных и молекулярно-биологических исследований НИИПЗ СО РАМН. Вопросы, приведенные в анкете, позволяют при формировании группы контроля исключить лица с возможными нарушениями соматического или психического здоровья. Исследование проводилось в строгом соответствии с биоэтическими нормами. Протокол исследования, информация для обследуемых лиц и форма информированного согласия были одобрены локальным этическим комитетом.

Забор венозной крови у здоровых доноров проводили утром, натощак. Лимфоциты выделяли из гепаринизированной крови общепринятым методом на градиенте плотности Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция). Далее клетки культивировали с тремя тестируемыми веществами: раствором Хенкса (контроль), 140 мкМ гидроперекиси третичного бутила (моделируя ситуацию окислительного стресса) и 0,5% этанолом. Указанные концентрации исследуемых веществ были подобраны исходя из литературных данных [3, 9]. Для изучения эффекта метаболического протектора «Кортексин» (ООО «Герофарм») лимфоциты предварительно инкубировали с 20 мкл препарата в концентрациях 0,1; 1, 10 мкг/мл в течение 18 часов, а затем добавляли исследуемые индукторы.

Концентрацию белков апоптоза Bcl-2 (антиапоптотического) и caspase-3 (проапоптотического) определяли в лизате клеток методом иммуноферментного анализа с использованием наборов human Caspase-3 instant ELISA и human Bcl-2 ELISA (Bender MedSystems GmbH, Vienna, Austria) на спектрофотометрическом анализаторе Epoch (США). Морфологические изменения лимфоцитов, характерные для апоптоза, оценивали методом световой микроскопии мазков крови. Мазки фиксировали 5 мин в азур-эозине метиленовом синем по Май-Грюнвальду и окрашивали 40 мин по Романовскому-Гимза.

Статистический анализ и обработку данных проводили с использованием пакета STATISTICA, версия 6.0 для Windows. Производили расчеты средней арифметической (М), среднеквадратического отклонения (σ), ошибки средней арифметической (m). Достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрического критерия Ман- на‒Уит­ни и Краскела‒Уолиса. Различия оценивали как достоверные при P < 0,05.

Для выяснения механизмов действия препарата кортексин на процессы запрограммированной клеточной гибели важным представляется исследование концентрации про- и антиапоптотических белков, поскольку именно относительный уровень протеаз определяет судьбу клетки. Белок Всl-2 (антиапоптотический) - один из основных регуляторов апоптоза, в случае избыточного присутствия данного белка в клетке, формируются факторы, ингибирующие апоптоз.

Уровень Bcl-2 в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров составил 12,2 ± 0,9 нг/мл. В культурах, подвергшихся действию окислительного стресса, индуцированного 4-часовой инкубацией с гидропероксидом третичного бутила, наблюдалось достоверное снижение уровня антиапоптотического белка (5,5 ± 0,8 нг/мл). Выявленные эффекты хорошо согласуются с данными других авторов о нарушениях процессов апоптоза различных типов клеток в условиях окислительного стресса [8]. Так, Tejedo J. с соавторами [14] доказали, что при действии оксида азота на клетку значимо понижается уровень внутриклеточного Bcl-2 белка. Добавление в культуральную среду 0,5% этанола не приводило к статистически значимым изменениям содержания Bcl-2 (рис. 1).

Предварительное культивирование клеток с кортексином приводило к нормализации количества антиапоптотического белка в лимфоцитах. Согласно полученным результатам, максимальный эффект оказывала концентрация препарата 1 мкг/мл, уровень белка составил 21,4 ± 0,8 нг/мл (12,2 ± 0,9 - в контроле) (рис. 2).

Активация каспаз является ключевым моментом в промежуточных и терминальных стадиях апоптоза. Количество caspase-3 в лимфоцитах здоровых доноров составило 3,8 ± 1,1 мкг/мл. Инкубация клеток с гидроперекисью приводила к увеличению уровня проапоптотического белка (4,8 ± 1,7 мкг/мл). Выявленные нами данные свидетельствуют о том, что в условиях окислительного стресса наблюдается индукция апоптоза лимфоцитов, что выражается в значительном увеличении уров- ня проапоптотического белка caspase-3. Инкубация клеток с этанолом не вызывала изменений концентрации caspase-3 (3,6 ± 0,5 мкг/мл,
в контроле - 3,8 ± 1,1 нг/мл) (табл. 1).

Примечание:

* - р < 0,05 по сравнению с контролем;

# - p < 0,05 по сравнению с инкубацией в тех же условиях без кортексина.

Все три концентрации кортексина оказывали протекторный эффект в отношении клеточной гибели лимфоцитов: уровень caspase-3 значительно снижается при добавлении в культуральную среду препарата по сравнению с интактными клетками.

Цитологический анализ мазков крови показал, что инкубация образцов с гидроперекисью третичного бутила приводила к снижению жизнестойкости мононуклеаров, наблюдалась тенденция к увеличению количества апоптотических клеток в популяции лимфоцитов по сравнению с контролем (8,2 ± 2,2 и 6,8 ± 0,6% соответственно). Число лимфоцитов, подвергшихся апоптозу под действием 0,5%-го этанола, составило 7,8 ± 2,1, что соответствует показателю в контрольной группе (табл. 2).

Примечания:

* - р < 0,05 по сравнению с контролем;

# - p < 0,05 по сравнению с инкубацией в тех же условиях без кортексина.

При долгосрочной прединкубации иммунокомпетентных клеток с кортексином (в 3 концентрациях) доля клеток с гранулированным хроматином ядра уменьшалась по сравнению с контрольным значением, что показывает антиапоптотическое действие исследуемого препарата. Максимальный эффект наблюдался при добавлении кортексина в концентрации 0,1 мкг/мл (1,5 ± 0,8%, в контроле - 6,8 ± 0,6%, p < 0,05) и добавлении кортексина в концентрации 10 мкг/мл (1,9 ± 0,8%, в контроле 6,8 ± 0,6, p < 0,05), в то же время концентрация 1 мкг/мл оказывает протективный эффект в условиях окислительного стресса, не влияя на интактные клетки и клетки, инкубированные с этанолом (см. табл. 2).

В результате проведенного исследования было показано токсическое влияние гидропероксида третичного бутила на процессы апоптоза лимфоцитов, в то время как инкубация клеток с этанолом не приводила к статистически значимым изменениям исследуемых параметров. Полученный результат подтверждает гипотезу о том, что в организме в условиях хронической алкоголизации на клетки может оказывать негативное действие не столько сам этанол, а продукты его метаболизма, в частности активные формы кислорода.

Кортексин снижает интенсивность свободнорадикального окисления, проявляет антиоксидантное действие, обладает нейропротекторным и антиапоптозным действием, воздействует на все этапы патологической цепи молекулярных событий, приводящих к гибели нейронов. Установлено, что кортексин снижает уровень апоптоза нейронов, вызванного избыточным накоплением глутамата в синаптической щели [13]. Микроэлементы (цинк, марганец, селен, медь и др.), содержащиеся в препарате, участвуют в поддержании активности более 1000 внутриклеточных белков и ферментов, регулирующих процессы клеточной динамики и апоптоза. В последние годы показано наличие у кортексина множественных эффектов, затрагивающих каскадную регуляцию апоптоза, экспрессию нейротрофических факторов, энергетическое обеспечение нервной клетки и митохондриальный потенциал, функционирование рецепторов глутамата и регулирование концентрации кальция в клетке, что выражается в нейропротекторном и нейротрофическом действии препарата [5]. Представленные выше собственные экспериментальные данные согласуются с литературными и свидетельствуют о том, что кортексин in vitro оказывает выраженный антиапоптотический эффект на лимфоциты периферической крови здоровых людей, защищая их от пагубного воздействия активных форм кислорода и этанола. Возможным механизмом реализации протекторного эффекта исследуемого препарата в отношении процессов апоптоза лимфоцитов является восстановление нарушенного баланса про- и антиапоптотических белков.

• Чурин А.А., д.м.н., руководитель отдела лекарственной токсикологии ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН, г. Томск;
• Невидимова Т.И., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Томск.

Работа поступила в редакцию 30.05.2012