Полиморфизм генов, ассоциированных с параметрами молочной продуктивности, позволяет вести селекцию домашних животных с учетом ценных генотипов в отношении хозяйственно полезных признаков. Установленный для крупного рогатого скота (КРС) спектр генов-кандидатов на связь с признаками молочной продуктивности включает в себя гены основных белков молока (лактальбуминов и казеинов), гены гормонов, стимулирующих их экспрессию, а также гены, продукты которых регулируют обмен протеинов и липидов в организме [7]. Среди них особое место занимают гены каппа-казеина, гормона роста и пролактина [1, 4, 9].

Каппа-казеин обеспечивает оптимальные технологические свойства молока при производстве сыра, поэтому его ген рассматривают в качестве одного из основных маркеров племенной ценности КРС [4]. Ген каппа-казеина (CSN3) у представителей вида Bos taurus L. находится на 6-й хромосоме. Из десяти описанных аллелей этого гена наиболее часто встречаются аллельные варианты A и B, которые отличаются двумя аминокислотными заменами
в 136-м Thr(A)/Ile(B) и 148-м Asp(A)/Ala(B) положениях полипептидной цепи. Многими зарубежными [11] и отечественными [5] исследователями установлена ассоциация B-аллеля гена CSN3 с более высоким содержанием белка в молоке и выходом сыра, а также с лучшими коагуляционными свойствами молока у КРС.

Гормон роста (bGH) – важнейший регулятор соматического роста животных, обладающий, в том числе лактогенным и жиромобилизующим действием. У КРС ген гормона роста локализован на 19-й хромосоме и состоит из пяти экзонов и четырёх интронов. AluI рестрикционный полиморфизм в пятом экзоне гена связан с трансверсией C-G, приводящей к замене в белковом продукте гена аминокислоты лейцин на аминокислоту валин (Leu на Val, 127 позиция). Рядом учёных [1, 2, 10] установлена связь различных полиморфных вариантов гена bGH с такими хозяйственно-полезными признаками КРС как рост и развитие, молочная продуктивность (удой, содержание жира и белка в молоке).

Пролактин (bPRL) – один из самых универсальных гормонов гипофиза с точки зрения его биологической активности. Он участвует в дифференцировке эпителиальных клеток молочной железы, инициации и поддержании лактации, регуляции синтеза молочных белков и жиров. Таким образом, ген пролактина является потенциальным генетическим маркером признаков молочной продуктивности в животноводстве. У КРС ген bPRL расположен на 23-й хромосоме и состоит, как и ген bGH, из пяти экзонов и четырёх интронов. Установлено, что синонимичная A-G замена, возникающая в кодоне для 103 аминокислоты, приводит к появлению полиморфного RsaI-сайта. Во многих исследованиях [2, 3, 9] показана связь RsaI-генотипов гена bPRL у КРС с параметрами молочной продуктивности.

Костромская порода КРС является одной из лучших отечественных пород мясо-молочного направления продуктивности. Исследованию ее генофонда по перечисленным молекулярным маркерам посвящены работы ряда авторов [6, 8], однако животные из хозяйства ОАО ПЗ «Караваево», являющегося родоначальником костромской породы, не были изучены.

Цель нашего исследования заключалась в изучении полиморфизма генов каппа-казеина, гормона роста и пролактина у коров костромской породы в связи с параметрами молочной продуктивности.

Материал и методы исследования

Исследования проведены в лаборатории сравнительной генетики животных ИОГен РАН. Материалом для исследований послужила кровь коров костромской породы (n = 125) из хозяйства ОАО ПЗ «Караваево» Костромской области. Кровь для выделения ДНК отбирали из ярёмной вены в объёме 5 мл в вакуумные пробирки с сухим ЭДТА К3 (ООО «ГЕМ», Россия). Геномную ДНК животных выделяли из 200 мкл цельной крови с использованием набора реагентов «DIAtomTMDNA Prep» (IsoGene Lab., Москва) согласно прописи, предоставленной изготовителем.

Тестирование А- и В-аллелей гена CSN3 проводили с помощью метода аллель-специфичной полимеразной реакции с использованием набора «GenePak k-Casein A/B PCR test» (IsoGene Lab., Москва) согласно прописи изготовителя. Амплификацию проводили в термоциклере «DNA Engine Dyad» (BioRad, США) в следующем режиме: первый цикл – 95 °С, 2 мин; последующие 32 цикла – 95 °С, 15 с; 62 °С, 40 с; 72 °С, 30 с; заключительный цикл – 72 °С, 7 мин.

Полиморфизм генов bGH и bPRL исследовали методом PCR-RFLP. Для амплификации фрагментов этих генов использовали следующие пары олигонуклеотидных праймеров, синтезированных в ООО НПФ «Литех» (г. Москва): GH-F: 5’-GCTGCTCCTGAGGGCCCTTCG-3’ и GH-R: 5’-GCGGCGGCACTTCATGACCCT-3’ (для гена bGH); PR3-F: 5’-CGAGTCCTTATGAGCTTGATTCTT-3’ и PR3-R: 5’- GCCTTCCAGAAGTCGTTTGTTTTC-3’ (для гена bPRL) [3]. Амплификацию проводили с применением набора «GenePakTM PCR Core» (IsoGene Lab., Москва) в термоциклере «Терцик» (ООО «ДНК-технология», Россия) в следующем режиме: для фрагмента гена bGH: первый цикл – 94 °С, 4 мин; последующие 35 циклов – 94 °С, 45 с; 65 °С, 45 с; 72 °С, 45 с; заключительный цикл – 72 °С, 7 мин.; для фрагмента гена bPRL: первый цикл – 95 °С, 5 мин; последующие 35 циклов – 95 °С, 30 с; 57 °С, 30 с; 72 °С, 30 с; заключительный цикл – 72 °С, 7 мин. Полученные продукты амплификации генов bPRL и bGH обрабатывали эндонуклеазами рестрикции RsaI и AluI соответственно в течение 20 часов при соблюдении условий, указанных фирмой-производителем (MBI Fermentas, Литва).

Размер продуктов рестрикции фрагмента гена bGH оценивали методом электрофореза в 2 %-м агарозном геле, а фрагмента гена bPRL – в 6 %-м полиакриламидном геле (1х TBE, бромистый этидий 0,5 мкг/мл, 100V). Результаты электрофореза регистрировали в ультрафиолете с использованием системы гельдокументации «UVT-1» (Biokom, Россия).

Удой, содержание жира и белка (кг, %) в молоке оценивали за 305 дней первой лактации по данным зоотехнического учёта (форма 2-мол). Статистическую обработку результатов проводили в программе «Microsoft Excel 2010». Достоверность попарных различий между средними значениями признаков оценивали с использованием критерия Стьюдента.

Результаты исследования
и их обсуждение

Проведённое исследование выявило полиморфизм всех рассматриваемых генов (табл. 1). В изученной выборке коров наблюдается значительное преобладание животных с генотипом AB (0,528) гена CSN3. Генотип AA, менее желательный при производстве молока, согласно работам [5, 11], был выявлен у 14 коров (0,112). Частота аллеля А составила 0,376, аллеля B – 0,624. В отношении гена bPRL было установлено, что частота аллеля А преобладает над частотой аллеля B более чем в два раза и составляет 0,72. Генотипы AA и AB гена пролактина у исследованных животных встречались примерно с одинаковой частотой – 0,496 и 0,448, соответственно. Частота генотипа BB у коров находилась на низком уровне и составила всего 0,056. Что касается гена bGH, то частота генотипа LL значительно превосходила частоту генотипа VL, и составила 0,88. Животных же c генотипом VV в данной выборке выявлено не было, что согласуется с ранее проведённым исследованием костромской породы [6].

Таблица 1

Частота генотипов и аллелей генов CSN3, bPRL и bGH
у коров костромской породы (n = 125)

Примечания: s.e. – стандартная ошибка; Hobs – наблюдаемая гетерозиготность; Hexp – ожидаемая гетерозиготность; c2 – критерий соответствия.

Не установлено статистически значимого отклонения эмпирического распределения частот генотипов от распределения генотипов по Харди-Вайнбергу ни по одному из генов, так же, как не установлено достоверных различий между значениями наблюдаемой (Hobs) и ожидаемой (Hexp) гетерозиготности (табл. 1).

В табл. 2 показана связь генотипов по локусам рассматриваемых генов с показателями молочной продуктивности коров за 305 дней 1-й лактации.

Таблица 2

Молочная продуктивность коров костромской породы с различными генотипами
(за 305 дней первой лактации)

Примечания: * – P < 0,05 и ** – P < 0,01 (критерий Стьюдента).

Из таблицы видно, что по процентному содержанию белка животные с генотипом BB гена CSN3 имели преимущество над животными с генотипом AA. За 305 дней лактации они продуцировали в среднем на 0,07 % (P < 0,05) больше белка. При рассмотрении молочной продуктивности животных с различными генотипами гена bPRL достоверных различий установлено не было. По исследованному SNP гена bGH было выявлено, что наибольшими показателями удоя (6456 кг) и количества молочного белка (208,5 кг) характеризовались животные с генотипом LL, что на 6,1 и 6,9 % больше, соответственно, чем у их сверстниц с генотипом VL. При этом коровы с генотипом VL продуцировали молоко с большим процентным содержанием жира, равным 4,38 % (на 0,25 % больше, P < 0,01).

При анализе совместного влияния рассматриваемых генов на показатели молочной продуктивности коров костромской породы в первой лактации из 15 выявленных комплексных генотипов нами было учтено восемь, частота которых превышала 2,4 %. Наиболее часто встречались животные с генотипами AB/AA/LL (25,8 %),
AB/AB/LL (20,0 %) и BB/AA/LL (16,8 %) (табл. 3).

Таблица 3

Молочная продуктивность коров костромской породы с различными комплексными генотипами за первую лактацию

Примечание: буквенными индексами (a, b) обозначены пары достоверно различающихся генотипов при уровне достоверности: * – P < 0,05 (критерий Стьюдента).

Проведённый анализ показал достоверное превосходство коров с генотипом AB/AA/LV по процентному содержанию жира в молоке над животными с генотипами AB/AA/LL и BB/AA/LL на 0,31 % (P < 0,05) и 0,38 % (P < 0,05) соответственно. Наблюдаемые между животными с генотипами AA/AB/LL и BB/AA/LL различия по процентному содержанию белка носят характер тенденции (P = 0,054). По другим генотипам достоверных различий в показателях молочной продуктивности за 305 дней первой лактации найдено не было.

Заключение

Итак, проведённое исследование свидетельствует о связи показателей молочной продуктивности у исследованных коров костромской породы из ОАО ПЗ «Караваево» с генотипами генов CSN3 и bGH. Полученные данные по ассоциации LL генотипа гена bGH с высокими показателями удоя и количества молочного белка за 305 дней первой лактации согласуются с закономерностями, описанными у коров черно-пестрой породы [10]. Выявленное преимущество костромских коров с VL генотипом этого же гена по содержанию молочного жира наблюдалось также у коров голштинской породы [12]. Отметим, что ранее достоверных связей показателей молочной продуктивности с геном bGH у костромского скота обнаружено не было, однако, была отмечена тенденция связи генотипа VL гена гормона роста (bGH) с более высоким содержанием жира по сравнению с генотипом
LL (P = 0,086) [6]. Наибольшим процентным содержанием белка в молоке характеризовались животные с генотипом BB гена CSN3, что не противоречит данным других авторов [5, 11]. В настоящем исследовании установлено, что коровы с комплексным генотипом AB/AA/VL (гены
CSN3/bPRL/bGH) продуцируют молоко со значимо более высоким содержанием молочного жира по сравнению с коровами генотипов AB/AA/LL и BB/AA/LL. Нами не было установлено влияния RsaI-полиморфизма гена bPRL на исследованные признаки, как и в работе [6].

Таким образом, при разведении и совершенствовании животных костромской породы КРС с целью повышения уровня и качества получаемого от них молока хозяйствам как племенных, так и товарных стад, целесообразно рассматривать полученные результаты как дополнительный критерий при ведении селекционно-племенной работы с использованием ДНК-маркеров при отборе и подборе животных. Однако следует отметить, что для массового применения установленных закономерностей на практике необходима проверка их универсальности на больших выборках животных.

Работа выполнена при поддержке программы ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы (Шифр лота: 2012-1.4-12-000-1001, шифр заявки: 2012-1.4-12-000-1001-007, Номер соглашения: 8088) и РФФИ (проект № 12-04-90880-мол_рф_нр).

Рецензенты:

Кокшарова О.А., д.б.н., в.н.с. Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, г. Москва;

Куликов А.М., д.б.н., с.н.с., ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Коль-
цова РАН», г. Москва.

Работа поступила в редакцию 16.10.2012.