Антимикробная активность наночастиц различных металлов, в том числе серебра, в настоящее время широко изучается и достаточно высока в отношении различных видов микроорганизмов. Одним из направлений практического использования наночастиц серебра является местное применение, в том числе в лечении и профилактике гнойной инфекции. К числу основных возбудителей последней относится Pseudomonasaeruginosa, которая имеет особое значение при внутрибольничных инфекциях благодаря широкому распространению в окружающей среде и способности быстро колонизировать ее объекты с формированием биопленок, а также Escherichiacoli. Данные виды относятся к грамотрицательным бактериям, имеющим в клеточной стенке липополисахаридный компонент, затрудняющий проникновение в клетку ряда веществ, в том числе некоторых антибиотиков [2, 5]. К тому же псевдомонады обладают природной устойчивостью ко многим липофильным антибиотикам (тетрациклинам, хлорамфениколу, ряду фторированных хинолонов) и способны образовывать внеклеточную слизь, которая может служить дополнительным механизмом переживания воздействия неблагоприятных факторов, среди которых нельзя исключить и наночастицы серебра [2]. В формировании биопленки как в условиях макроорганизма, так и вне его одним из стартовых механизмов является адгезия, поэтому возможность прерывания или замедления развития этого процесса под воздействием наночастиц серебра имеет теоретическое и практическое значение.

Целью нашего исследования послужила оценка влияния наночастиц серебра на адгезивную активность штаммов P.aeruginosa и E.coli.

Материал и методы исследования

В работе использованы 9 штаммов – один стандартный штамм (P.aeruginosa АТСС 27853) и по 4 клинических штамма каждого вида, выделенных от больных с гнойной инфекцией мягких тканей. Коллоидный раствор наночастиц серебра кубической формы с размером граней 20 нм любезно предоставлен Институтом биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии наук. Предварительно у опытных штаммов методом двукратных серийных разведений в мясопептонном бульоне определяли минимальную задерживающую концентрацию (МЗК) наночастиц серебра и аминогликозида гентамицина как препарата сравнения [4]. Суточные чистые культуры штаммов в течение суток инкубировали в мясопептонном бульоне, содержащем субингибирующие концентрации (1/4 МЗК) наночастиц и антибиотика, используя также посевы без обоих веществ в качестве контроля. Микробная нагрузка составила 2∙105 микробных тел/мл по стандарту мутности McFarland. Адгезивную активность изучали экспресс-методом, предложенным В.И. Брилис и соавторами, на свежих эритроцитах O(I) Rh(+) [3]. Для этого эритроциты трижды отмывали 0,1 М раствором фосфатного буфера путем центрифугирования и готовили взвесь эритроцитов концентрацией 108 клеток/мл. На чистом обезжиренном предметном стекле суспензировали по одной бактериологической петле бульонной культуры каждого штамма и одной капле взвеси эритроцитов. После 30 минут инкубации при 37 °С во влажной камере предметные стекла высушивали и фиксировали жаром, после чего окрашивали водным фуксином. Адгезивную активность каждой опытной культуры оценивали при иммерсионной микроскопии, подсчитывая количество бактериальных клеток, прикрепившихся к 5 эритроцитам в каждом из пяти просмотренных полей зрения, и рассчитывая средний показатель адгезии (СПА) как среднюю арифметическую. Микроорганизмы при СПА 1,01–2,0 считали низкоадгезивными, 2,01–4,0 – среднеадгезивными, более 4,0 – высокоадгезивными. Статистическую обработку проводили согласно методике оценки существенности различий между найденными в опыте средними величинами, то есть СПА [1].

Результаты исследования и их обсуждение

Все взятые в опыт культуры были чувствительны к гентамицину согласно полученным значениям МЗК 0,125–8 мкг/мл [4]. МЗК наночастиц серебра для всех штаммов E.coli составила 5 мкг/мл, для штамма P.aeruginosaATCC 27853 – 80, клинических штаммов P. aeruginosa № 2, 4 – 5 мкг/мл, № 3 – 20 мкг/мл.

Все штаммы E.coli обладали высокой адгезивной активностью: СПА 5,04 – 7, 4 штамма P.aeruginosa (стандартный, № 2, 3, 4) – средней (СПА 2,32 – 3,64) и один штамм (№ 1) – высокой (СПА 5,95) адгезивной активностью (таблица). После культивирования в субингибирующих концентрациях гентамицина адгезивная активность согласно значениям СПА существенно снизилась по сравнению с контролем у 2 штаммов P.aeruginosa (№ 1 – СПА 3,08 ± 1,19 и № 4 – СПА 1,32 ± 0,46), у стандартного штамма умеренно возросла (СПА 4,6 ± 0,49), у штаммов № № 2, 3 ее достоверного изменения не произошло. Культивирование в данных условиях также привело к снижению адгезивной активности по сравнению с контролем у всех штаммов E.coli (СПА штамма № 1 – 2 ± 0,8, № 2 – 1,96 ± 0,77, № 3 – 1,56 ± 0,63, № 4 – 1,24 ± 0,42 при соответствуюших контрольных значениях 5,04 ± 1,14, 6,88 ± 0,81, 7 ± 0,93 и 5,84 ± 1,04).

СПА штаммов P.aeruginosa и E.coli

Примечание. * – недостоверные различия между значениями СПА после культивирования в 1/4 МЗК гентамицина и 1/4 МЗК наночастиц.

После культивирования в субингибирующих концентрациях наночастиц у всех штаммов обоих видов отмечалось существенное по сравнению с контролем снижение СПА. При этом значения СПА 4 штаммов P.aeruginosa и 2 штаммов E.coli, культивированных в субингибирующих концентрациях наночастиц, были достоверно ниже, чем в условиях культивирования в субингибирующих концентрациях гентамицина: СПА штаммов псевдомонад – P.aeruginosa АТСС 27853, № 1, 2 и 3, E.coli № 1,2 после культивирования в 1/4 МЗК гентамицина – 4,6 ± 0,49, 3,08 ± 1,19, 2,84 ± 0,92 и 3,28 ± 0,6, 2 ± 0,8, 1,96 ± 0,77, в то время как после культивирования в 1/4 МЗК наночастиц – 2,92 ± 0,89, 1,8 ± 0,63, 1,16 ± 0,37 и 2,4 ± 0,8, 1,56 ± 0,63, 1,4 ± 0,48 соответственно.

Таким образом, наночастицы серебра в субингибирующих концентрациях угнетают адгезивную активность опытных штаммов P.aeruginosa и E.coli как представителей грамотрицательных бактерий, независимо от липидной составляющей их клеточной стенки и наличия внеклеточной слизи у псевдомонад. Известно, что через клеточную стенку грамотрицательных бактерий транспорт водорастворимых антибиотиков осуществляется через пориновые каналы липополисахаридного слоя, диаметр которых составляет 2 нм [5]. При этом для аминогликозидов характерно самопромотирующее действие в процессе проникновения в клетку (благодаря поликатионной химической структуре они связываются с анионами липолисахарида и вызывают в нем конформационные изменения, повышая проницаемость липополисахаридного слоя) [2, 8]. Подобный механизм проникновения может способствовать и проникновению наночастиц серебра с размерами большими, чем пориновые каналы. Механизм действия наночастиц серебра на грамотрицательные бактерии обусловлен, во-первых, взаимодействием их с внешней мембраной, которое приводит к формированию так называемых воронок, в месте которых повышается ее проницаемость, а во-вторых, с индукцией свободно-радикального повреждения мембран [6, 9, 10]. Адгезия грамотрицательных бактерий, в том числе P.aeruginosa, происходит к поверхности эукариотических клеток за счет пилей, кончики которых контактируют со специальными участками клеточной мембраны, проходя через них как через воротничок для закрепления на внутренней стороне [7]. Очевидно, что действие наночастиц серебра и гентамицина имеет общий результат – деструкцию цитоплазматической мембраны, а, как следствие, цитолиз клеток и повреждение фимбриальных адгезинов – выростов цитоплазмы бактериальной клетки. Благодаря этому они не уступают друг другу по способности нарушать адгезивную активность опытных штаммов.

Выводы

Субингибирующие концентрации наночастиц серебра (1/4 МЗК) угнетают адгезивную активность опытных штаммов P.aeruginosa и E.coli, не уступая подобному эффекту гентамицина и даже превосходя его для большинства опытных штаммов. Это делает перспективным применение препаратов наночастиц не только для местного лечения инфекций, вызываемых данными видами бактерий, но и профилактики их возникновения.

Рецензенты:

Щербаков А.А., д.б.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологи и иммунологии, «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова», г. Саратов;

Тихомирова Е.И., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой экологии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.», г. Саратов.

Работа поступила в редакцию 22.05.2013.