Несмотря на огромное количество работ в области применения гипотермии при операциях на магистральных сосудах, головном мозге, органах грудной клетки как метода подавления избыточных реакций организма на оперативное вмешательство, предупреждения развития тяжелой гипоксии и повышения устойчивости головного мозга к кислородному голоданию [9–11, 19, 21, 23], механизмы, лежащие в основе протективных механизмов гипотермии при ишемических/гипоксических повреждениях мозга, изучены недостаточно.

Патофизиологической основой развития ишемического и реперфузионного повреждений мозга является нарушение кровоснабжения мозга [15–16]. Ишемия мозга провоцирует энергетическое голодание мозговой ткани, повреждение мембран клеток мозга вследствие высокой реактивности свободных радикалов в мозге. В результате данных изменений в нейронах и глиальных клетках головного мозга нарушаются процессы рецепторного связывания [3–4, 13]. Также ишемические и реперфузионные изменения мозга способствует аккумуляции повреждений структуры ДНК в результате окислительного стресса, что в дальнейшем приводит к запуску процесса гибели клетки [20]. Каскад реакций, сопровождающих ишемические/реперфузионные повреждения мозга, сопровождаются гипертермией, что усугубляет степень повреждений нейронов мозга [22].

В то же время умеренная гипотермия на фоне или сразу после церебральной ишемии оказывает нейропротективное действие за счет снижения окислительных повреждений ДНК и структурных элементов мембраны клетки [18], повышения выживаемости нейронов в результате понижения активности проапоптотических и некротических факторов [24]. Таким образом, температура мозга является одним из наиболее значимых факторов, определяющих функциональное состояние мозга.

В связи с вышесказанным в экспериментальных моделях и клинических испытаниях важна разработка комбинированной патофизиологически значимой терапии с количественной оценкой обратимости повреждений вещества мозга при ишемии/гипоксии [8]. Таким образом, применение сочетанного действия умеренной гипотермии и препаратов-нейропротекторов на фоне нарушения мозгового кровообращения является актуальным в решения вопроса эффективности снижения последствий ишемического/реперфузионного повреждения мозга. В этой связи актуальным является исследование эффектов ноотропных препаратов и гипотермии при ишемизации мозга.

Целью данного исследования явилось изучение влияния умеренной гипотермии и введения церебрамина на показатели свободнорадикального окисления в мозге крыс, подвергнутых двусторонней окклюзии сонных артерий.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили 128 белых беспородных половозрелых крыс-самцов в возрасте 6-ти месяцев, массой 200–250 г. Животных содержали в условиях вивария при температуре +18–20 °С на стандартном рационе питания. Для избежания сезонных колебаний метаболизма и регуляции функций, опыты проводили в зимние месяцы: декабрь – февраль.

Животные были разделены на следующие группы: 1-я группа – ложнооперированные крысы (л/о, контрольная группа, n = 16). 2-я группа – животные, которым проводили перевязку правой сонной артерии (ПСА) на 3 минуты (с последующей 24-часовой реоксигенацией) и левой сонной артерии (ЛСА) на 24 часа (n = 16). 3-я группа – животные, которым перорально (per os) вводили церебрамин в течение 5 суток в (кормление 1 раз в сутки в утренние часы) в дозе 0,5 мг/кг с последующим проведением ложной операции (n = 16). 4-я группа – животные, которым перед проведением 3-минутной окклюзии ПСА и 24-часовой окклюзии ЛСА перорально вводили церебрамин в дозе 0,5 мг/кг в течение 5 суток (n = 16). 5-я группа – животные, которых после проведения ложной операции помещали в холодовую камеру с охлаждаемой водяной рубашкой, конструкция которой позволяла регулировать уровень охлаждения и непрерывно фиксировать термодатчиком ректальную температуру тела животного с точностью до 0,010 °С (n = 16). 6-я группа – животные, которых после проведения 3-минутной окклюзии ПСА и 24-часовой окклюзии ЛСА помещали в холодовую камеру (n = 16). 7-я группа – животные, которым перорально вводили церебрамин в течение 5 суток. После проведения ложной операции крыс помещали в холодовую камеру (n = 16). 8-я группа – животные, которым перед проведением 3-минутной окклюзии ПСА и 24-часовой окклюзии ЛСА перорально вводили церебрамин в дозе 0,5 мг/кг в течение 5 суток. После проведения операции крыс помещали в холодовую камеру (n = 16).

Через 24 часа после операций животных декапитировали, мозг извлекали на холоде и выделяли кору и стволовые структуры. Ишемизацию мозга моделировали путем перевязки левой сонной артерии на 24 часа и через минуту правой сонной артерии на 3 минуты с последующей 24-часовой реоксигенацией [2]. Гипотермию моделировали путем помещения животных 5–7 групп в холодовые камеры до тех пор, пока ректальная температура крысы не опускалась до 30 °С (умеренная гипотермия). Температура воды в водяной рубашке составляла 8 °С.

Содержание ТБК-реактивных продуктов определяли флюориметрическм методом, описанным А.В. Арутюнян и др. [1]. Активность глутатионпероксидазы определяли по скорости окисления восстановленного глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила по методу [17]. Определение концентрации ВГ проводили методом G.L. Ellman [14]. Активность глутатионредуктазы определяли по скорости окисления НАДФН2 методом [12]. Определение активности глутатион-S-трансферазы проводили по методу, описанному в пособии [6]. Активность каталазы определяли методом М.А. Королюка.

Результатов исследования и их обсуждение

В табл. 1–2 представлены результаты исследования состояния про- и антиоксидантного статуса в мозге экспериментальных животных. В модели окклюзии сонных артерий (2 группа) выявлено накопление гидроперекисей липидов и ТБК-реактивных продуктов в мозге крыс на фоне повышения активности ГПО и ГТ, а также снижения содержания ВГ по сравнению с контролем. Кроме того, показано снижение активности ГР в коре больших полушарий относительно контрольной группы. Следовательно, в условиях окклюзии сонных артерий недостаточная активация ферментов, восстанавливающих образующиеся гидроперекиси липидов, способствует накоплению вторичных продуктов свободнорадикальных процессов (СРП) в структурах мозга животных. Вероятно, это наблюдается по причине снижения синтеза ВГ и активности ГР в клетках в условиях развивающегося ацидоза при ишемии мозга.

Таблица 1

Влияние церебрамина и гипотермии на содержание гидроперекисей липидов, ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП), восстановленного глутатиона (ВГ), активность каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионредуктазы (ГР) в коре больших полушарий крыс, (M ± m)

Примечание. * достоверные (р < 0,05) отличия показателей относительно контрольных значений.

Таблица 2

Влияние церебрамина и гипотермии на содержание гидроперекисей липидов, ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП), восстановленного глутатиона (ВГ), активность каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионредуктазы (ГР) в стволовых структурах мозга крыс, (M ± m)

Примечание. * достоверные (р < 0,05) отличия показателей относительно контрольных значений.

При моделировании гипотермии (5 группа) также наблюдали повышение содержания липоперекисей и ТБК-реактивных продуктов в структурах мозга животных. Однако антиоксидантный статус в коре больших полушарий и стволовых структурах различался. В том числе в коре больших полушарий установлено снижение уровня ВГ и активности ГР, тогда как в стволовых структурах на фоне снижения активности ГР и каталазы выявлено увеличение активности ГТ и содержания ВГ по сравнению с контрольной группой. В результате накопление вторичных продуктов СРП в коре больших полушарий было выше, чем в стволовых структурах.

У животных в модели окклюзии сонных артерий и последующей гипотермии (6 группа) повышение содержания липоперекисей в структурах мозга было менее выражено относительно крыс, которым моделировали ОСА или гипотермию: в 6 группе крыс значительное накопление первичных продуктов СРП наблюдали только в коре больших полушарий относительно контроля. Одновременно наблюдали повышение активности ГПО и ГТ на фоне снижения содержания ВГ в мозге. Однако такие изменения происходили при разнонаправленных изменениях активности ГР в структурах мозга: если в коре больших полушарий происходило снижение данного показателя, то в стволовых структурах – его повышение относительно контрольной группы. Также в стволовых структурах показано возрастание каталазной активности по сравнению с 1-й группой крыс. Таким образом, в данной модели эксперимента установлены особенности ответа антиоксидантного звена свободнорадикальных процессов в разных структурах мозга: предотвращение чрезмерной активации СРП в коре больших полушарий происходит на фоне увеличения антиоксидантной емкости ГПО и ГТ, тогда как в стволовых структурах – преимущественно за счет активации ГТ и каталазы. Известно, что сродство ГПО к пероксиду водорода выше, чем у каталазы, поэтому первая более эффективно работает при низких концентрациях субстрата, в то же время при высоких концентрациях ключевая роль принадлежит каталазе [7]. Действительно, согласно полученным результатам исследования, именно в коре больших полушарий происходило накопление гидроперекисей.

При введении церебрамина (3 группа) увеличение содержания ТБК-реактивных продуктов происходило только в коре больших полушарий крыс относительно контроля. Одновременно показано увеличение в структурах мозга также уровня ВГ, активности ГТ и каталазы; в коре больших полушарий также обнаружено возрастание активности ГПО. Повышение про- и антиоксидантных звеньев свободнорадикальных процессов при введении пептидных препаратов связывают с так называемым их прекондиционирующим эффектом [5].

В условиях введения церебрамина перед моделированием ОСА (4 группа) в мозге выявлено накопление липоперекисей и ТБК-реактивных продуктов, активности ГПО и ГТ относительно контроля. Также в коре больших полушарий была снижена активность ГР и повышена каталазная активность, в то же время в стволовых структурах активность ГР была выше контрольного уровня. Следовательно, введение церебрамина перед ОСА снижает интенсивность СРП в мозге животных, однако механизмы, лежащие в основе данного явления, различаются в коре больших полушарий и стволовых структурах: в коре больших полушарий большую роль в снижении накопления продуктов СРП берут на себя ферменты, обладающие каталазной активностью, тогда как в стволовых структурах – глутатионтрансфераза.

При введении церебрамина перед гипотермией (7 группа) изменения показателей СРП установлены только в стволовых структурах: происходило повышение уровня липоперекисей и активности глутатионтрансферазы по сравнению с контролем. В модели введения ноотропа перед ОСА и моделированием гипотермии (8 группа) также выявлены минимальные отклонения от контрольного уровня в состоянии СРП. Так, в коре больших полушарий показано накопление липоперекисей на фоне снижения активности ГР, а также активности ГПО (0,1 < р < 0,05); в стволовых структурах наблюдали лишь повышение активности ГТ.

Таким образом, сочетанное влияние церебрамина и гипотермии оказывает более существенное протективное действие на метаболические процессы в структурах мозга крыс при окклюзии сонных артерий, нежели их раздельное применение в качестве факторов, снижающих эффекты ишемии мозга. Также установлены региональные различия защитных механизмов против развития окислительного повреждения ткани мозга.

Рецензенты:

Кличханов Н.К., д.б.н, профессор кафедры биохимии и биофизики, Минобрнауки России, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дагестанский государственный университет», г. Махачкала;

Габибов М.М., д.б.н., профессор, зав. кафедрой физиологии, анатомии и гистологии, Минобрнауки России, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дагестанский государственный университет», г. Махачкала.

Работа поступила в редакцию 16.08.2013.