Лекарственные препараты на основе надземной части горца почечуйного, или почечуйной травы (Polygonum persicaria L., сем. Гречишных – Polygonaceae) обладают кровоостанавливающими, противовоспалительными, бактерицидными, обезболивающими и диуретическими свойствами [1, 3, 5]. Фармакологическое действие препаратов данного растения обусловлено целым рядом веществ, в том числе флавоноидами [3, 5], однако литературные данные относительно их компонентного состава достаточно противоречивы. В отечественной литературе сообщается, что в траве горца почечуйного содержатся кверцетин, авикулярин, кверцитрин, изокверцитрин, гиперозид, рутин [3, 5]. По данным зарубежных ученых [6, 7], в траве данного растения наряду с рутином и кверцетином содержатся таксифолин, рамнетин, кемпферол, лютеолин.

В фармакопейной статье 58 Государственной фармакопеи СССР XI издания «Горца почечуйного трава» отсутствуют разделы «Качественные реакции» и «Количественное определение», что свидетельствует об актуальности научного обоснования разработки методик качественного и количественного анализа с использованием современных инструментальных возможностей (ТСХ, УФ-спектроскопия и др.) [2, 4].

Цель настоящего исследования – разработка методик качественного анализа количественного определения содержания суммы флавоноидов в траве горца почечуйного.

Материал и методы исследования

Объектом исследования служила надземная часть почечуйной травы, заготовленная в июле 2012 г. в Самарской обл. (окр. г. Самары). Воздушно-сухую надземную часть горца почечуйного (100 г) подвергали исчерпывающему экстрагированию 70 % этиловым спиртом, сочетая при этом способ мацерации (24 ч) с последующей экстракцией при температуре 85–90 °С. Водно-спиртовые экстракты упаривали под вакуумом до густого остатка (около 50 мл). Сгущенный экстракт высушивали на силикагеле L 40/100 и полученный порошок (экстракт + силикагель) наносили на слой силикагеля, сформированный в хлороформе. Хроматографическую колонку элюировали хлороформом и смесью хлороформ-этанол в различных соотношениях (99:1; 98:2; 97:3; 95:5; 93:7; 90:10; 85:15; 80:20; 70:30, 60:40, 50:50). Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ-анализа на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системах хлороформ-этанол (9:1), хлороформ-метанол-вода (26:14:3), а также н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:1:2). Фракции, содержащие вещество 1, были объединены, а выпавшие из них осадки отделены и затем перекристаллизованы из водного спирта. Фракции, содержащие вещества 2 и 3, подвергали рехроматографированию на колонке с силикагелем L 40/100 с использованием смеси гексана и хлороформа в градиентном режиме. Перекристаллизацию соединений 2 и 3 осуществляли из смеси хлороформ-гексан. В ходе разработки методики количественного определения содержания суммы флавоноидов изучены УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из травы горца почечуйного. Регистрацию спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena).

Cпектры ЯМР 1Н получали на приборах «Bruker AM 300» (300 МГц), масс-спектры снимали на масс-спектрометре «Kratos MS-30», регистрацию УФ-спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena).

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенных исследований из надземной части почечуйной травы выделены три флавоноида – изокверцитрин (1), пиностробин (2) и персикохалкон (3), являющийся новым природным соединением.

1. Изокверцитрин (3-О-β-D-глюкопиранозид 3,5,7,31,41-пентагидроксифлавона). Светло-желтое кристаллическое вещество состава С21Н20О12 с т.пл. 224–226 °С (водный спирт), масс-спектр (70 eV, 200 °С, m/z, %): 300 (М+ агликона, 100 %), 153 (15), 152 (43), 121 (9). УФ-спектр: lmax 257, 268 пл, 361 нм; + NaOAc 273, 380 нм; + NaOAc + H3BO3 262, 378 нм; +А1С13 274, 415 нм; +А1С13 + HCl 270, 404 нм, 1Н-ЯМР-спектр (300 МГц, DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 12.64 (1 H, с, 5-ОН), 7,68 (1Н, дд, 2.5 и 9 Гц, Н-61), 7.53 (д, 2,5 Гц, Н-21), 6,82 (1 Н, д, 9 Гц, Н-51), 6.31 (1 Н, д, 2,5 Гц, Н-8), 6,20 (1 Н, д, 2,5 Гц, Н-6), 5,38 (д, 7 Гц, Н-111 глюкозы), 3,1–4,5 (м, 6Н глюкозы).

2. Пиностробин (5-гидрокси-7-метоксифлаванон) – блестящие пластинчатые кристаллы белого цвета состава C16H14O4, масс-спектр (70 eV, 200 оС, m/z, %): М+ 270 (98 %), 193 (72), 167 (18), 166 (62), 149 (100), 105 (62), т.пл. 124–126 °С (из смеси хлороформ-гексан). lmax EtOH 290, 325 (пл.) нм. 1Н-ЯМР-спектр в дейтерохлороформе (300 МГц, CDCl3, δ, м.д., J/Гц): 12.04 (1Н, с, 5-ОН), 7.15-7.60 (5Н-Аr, м), 6.09 (1 Н, д, J = 2.5, Н-8), 6.07(1 Н, д, J = 2,5, Н-6), 5,44 (дд, 4 и 12 Гц, Н-2ах), 3,82 (3Н, с, СН3О), 3.12 (1 Н, дд, 12 и 17 Гц, Н-3ах), 2,83 (1 Н, дд, 4 и 17 Гц, 3-eq).

3. Персикохалкон (61-гидрокси-21,41-диметоксихалкон) – аморфный порошок оранжевого цвета состава C17H16O4, масс-спектр (70 eV, 200 °С, m/z, %): М+ 284 (100 %), 196 (65), 183 (3), 181 (22), 168 (8), 167 (17), 166 (30), 153 (5), 152 (8), 138 (28), 95 (63). lmax EtOH 341 нм, 1Н-ЯМР-спектр (300 МГц, CDCl3, δ, м.д., J/Гц): 14.30 (1 Н, с, 61-ОН), 7.93 (1 Н, д, 16 Гц, Н-b), 7,81 (1Н, д, 16 Гц, Н-a), 7,35–7,70 (5 Н-Аг, м), 6,16 (1 Н, д, 2 Гц, Н-51), 5,98 (1 Н, д, 2 Гц, Н-31), 41-СН3О, 3,95 (3 Н, с, 41-СН3О), 3.85 (3 Н, с, 21-СН3О).

Нами изучена возможность определения подлинности с использованием в разделе ТСХ и УФ-спектроскопии. Показано, что на уровне ГСО пиностробина обнаруживается пятно с величиной Rf около 0,8, имеющее ярко-голубую флуоресценцию при длине волны 366 нм и приобретающее после проявления раствором диазобензолсульфокислоты желтую окраску (пиностробин). Достаточно информативен и электронный спектр водно-спиртового извлечения из травы горца почечуйного (рис. 1): два интенсивных максимума поглощения при длине волны lmax = 274 ± 3 нм и «350 ± 3 нм (флавоноиды) (рис. 1).

При разработке методики количественного определения суммы флавоноидов в сырье «Горца почечуйного трава» нами определены оптимальные параметры: экстракция 70 % этиловым спиртом в соотношении «сырье – экстрагент» – 1:30, экстракция на кипящей водяной бане в течение 60 мин, определение оптической плотности раствора в условиях дифференциальной спектрофотометрии при аналитической длине волны 410 нм (рис. 2). Для расчета содержания суммы флавоноидов нами определен удельный показатель поглощения изокверцитрина, который, по нашим данным, является доминирующим флавоноловым гликозидом и во многом определяет спектральные характеристики (рис. 3).

Следовательно, для количественного определения содержания суммы флавоноидов в траве горца почечуйного целесообразно использовать метод дифференциальной спектрофотометрии при аналитической длине волны 410 нм, используя при этом значение удельного показателя поглощения (Е1 %1см) = 300.

Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве горца почечуйного. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл 70 % этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через фильтр (красная полоса) и охлаждают в течение 30 мин (извлечение из травы). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 3 %-го спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 95 %-м этиловым спиртом (испытуемый раствор А). В качестве раствора сравнения используют раствор, приготовленный при тех же условиях, но без добавления алюминия хлорида (раствор сравнения А). Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре при длине волны 410 нм.

Рис. 1. УФ-спектр спиртового раствора водно-спиртового извлечения из травы горца почечуйного: 1 – извлечение; 2 – извлечение с добавлением алюминия хлорида

Рис. 2. УФ-спектр спиртового раствора водно-спиртового извлечения из травы горца почечуйного (дифференциальный вариант)

Рис. 3. УФ-спектр спиртового раствора изокверцитрина: 1 – исходный раствор; 2 – раствор с добавлением алюминия хлорида

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на изокверцитрин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

где A – оптическая плотность испытуемого раствора; m – масса сырья, г; 300 – удельный показатель поглощения изокверцитрина, г; W – потеря в массе при высушивании, в процентах.

С использованием разработанной методики проанализирован ряд образцов травы горца почечуйного и показано, что содержание суммы флавоноидов в образцах сырья варьируется в пределах от 1,77 до 2,58 % (в пересчете на изокверцитрин). Это позволяет предварительно рекомендовать в качестве числового показателя «содержание суммы флавоноидов» значение «не менее 1,5 %». Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы флавоноидов в траве горца почечуйного с доверительной вероятностью 95 % составляет ±4,15 %.

Выводы

Из травы горца почечуйного выделены доминирующие флавоноиды пиностробин, изокверцитрин, а также новое природное соединение – 61-гидрокси-21,41-диметоксихалкон (персикохалкон), имеющие диагностическое значение. Разработаны методики качественного анализа травы горца почечуйного с использованием тонкослойной хроматографии (обнаружение пиностробина) и спектрофотометрии (максимумы поглощения при длине волны 274 ± 3 нм и 350 ± 3 нм). Разработана методика количественного определения содержания суммы флавоноидов в траве горца почечуйного с использованием дифференциальной спектрофотометрии при аналитической длине волны 410 нм. Определено, что содержание суммы флавоноидов в траве горца почечуйного варьируется от 1,77 до 2,58 % (в пересчете на изокверцитрин).

Рецензенты:

Первушкин С.В., д.фарм.н., профессор, зав. кафедрой фармацевтической технологии, ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Самара;

Шаталаев И.Ф., д.б.н., профессор, зав. кафедрой химии фармацевтического факультета, ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Самара.

Работа поступила в редакцию 21.07.2013.