Эндотоксины (липополисахариды (LPS)) играют важную роль в грамотрицательном сепсисе и других заболеваниях [8]. Поступая в кровь, LPS взаимодействуют с клетками-мишенями, что приводит к образованию рецепторного комплекса в мембране клеток [10]. Далее сигнал от этого комплекса передается через сигнальные пути к факторам транскрипции клеток. После этого развивается клеточный ответ, который характеризуется увеличением генерации активных форм кислорода (АФК), факторов адгезии, синтезом провоспалительных цитокинов [2]. При сепсисе и других воспалительных заболеваниях происходит увеличение синтеза и секреции белков теплового шока, в том числе белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (HSP70), увеличивается их концентрация в крови [9]. HSP70 играет важную роль в механизме защиты организма от теплового и других видов стресса. Ранее нами было показано, что внеклеточный HSP70 подавляет LPS-индуцируемую активацию нейтрофилов [1]. В данной работе исследовано действие HSP70 на внутриклеточные сигнальные пути, участвующие в генерации АФК фагоцитами крови (нейтрофилами и моноцитами), при действии LPS.

Материалы и методы исследования

Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров-добровольцев методом дифференциального центрифугирования на 2-слойном градиенте фиколла–верографина (1,119 и 1,077 г/мл)[1]. Моноциты выделяли центрифугированием мононуклеарной фракции на градиенте перколла плотностью 1,064 г/мл [12]. Генерацию АФК определяли методом хемилюминесценции (ХЛ) с использованием люминола по [1]. HSP70 получали, как описано в [11]. Для исследования роли сигнальных путей в механизме действия HSP70 на клетки были использованы: SB203580 (ингибитор p38 MAPK), PD98059 (ингибитор ERK1), U0126 (ингибитор ERK1/2), вортманнин (ингибитор PI3K), LY294002 (ингибитор PI3K), U73122 (ингибитор PLC), SP600125 (ингибитор JNK), Bay 11-7082 (ингибитор NF-κB). Ингибиторы инкубировали с клетками в течение 30 мин, затем добавляли HSP70. Через 10 минут после добавления 1 мкг/млHSP70 к клеткам добавляли 20 нг/мл LPS и праймировали клетки в течение 20 мин. В качестве вторичного стимула использовали 1 мкМ formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine(fMLP). В работе использовали реактивы фирмы Sigma-Aldrich (США).Результаты экспериментов приведены в виде значений в процентах от контроля ± стандартная ошибка среднего. Для сравнения активирующего и ингибирующего воздействия HSP70, LPS в таблицах приведены экспериментальные результаты за вычетом контроля (100 %).

Результаты исследования и их обсуждение

Одним из ранних событий ответа фагоцитов на действие эндотоксинов является продукция АФК этими клетками. НАДФН-оксидаза играет важную роль в патогенезе сепсиса [5]. Ранее нами было показано, что внеклеточный HSP70 значительно снижает LPS-индуцированную генерацию АФК этими клетками, т.е. защищает фагоциты от действия эндотоксинов [1]. Известно, что сборка и активация NADPH-оксидазы напрямую зависят от активации фосфолипазы C (PLC) и фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K)[4].

Мы исследовали участие фосфолипазы С в продукции АФК нейтрофилами и моноцитами с использованием ингибитора PLC-U73122. Полученные нами данные показали, что PLC участвует в генерации АФК нейтрофилами при действии LPS, поскольку U73122 в концентрации 1 мкг/мл на 54,6 % снижает генерацию АФК контрольных клеток (табл. 1) и на 196,2 % LPS-праймированных нейтрофилов (табл. 1). В моноцитах U73122 на 13 % увеличивает генерацию АФК контрольных клеток, но на 65 % уменьшает индуцируемый LPS респираторный взрыв этих клеток (табл. 2). HSP70 отменял вызванное действием U73122 ингибирование продукции АФК нейтрофилами и моноцитами. В работе [3] было показано, что ингибирование фосфолипазы C под действием U73122 заканчивалось быстрым, в течение 10 минут, уменьшением содержания внутриклеточного HSP70. Исходя из наших данных и результатов [3], можно предположить, что U73122 ингибирует PLC, приводя к снижению содержания внутриклеточного и повышению внеклеточного HSP70, а истощение внутриклеточного белка, в свою очередь, приводит к повышению активации NADPH-оксидазы с участием PLC в процессе продукции АФК.

Инкубирование нейтрофилов и моноцитов с 50 нМ вортманнина – ингибитора PI3K – примерно на 50 % снижает генерацию АФК как контрольными, так и LPS-праймированными клетками (табл. 1 и 2). Это может указывать на то, что LPS для индукции АФК использует не только PI3K- зависимую передачу сигнала, но и другие сигнальные молекулы для активации NADPH-оксидазы. В присутствии HSP70 вортманнин лишь незначительно ингибировал продукцию АФК нейтрофилами и моноцитами (табл. 1 и 2). Вортманнин незначительно ингибировал генерацию АФК нейтрофилами и не влиял на уровень ХЛ моноцитов в случае предварительного инкубирования клеток с HSP70 перед последующим добавлением LPS.

Таблица 1

Влияние ингибиторов сигнальных путей на генерацию АФК нейтрофилами

Другим ингибитором PI3K является LY294002, который в отличие от вортманнина ингибирует еще и протеинкиназу В (PKB) [7]. В наших экспериментах LY294002 в концентрации 2 мкМ снижал активированное LPS увеличение хемилюминесценции клеток, а также генерацию АФК в присутствии HSP70 (табл. 1 и 2).

Таблица 2

Влияние ингибиторов сигнальных путей на генерацию АФК моноцитами

Эффект защиты нейтрофилов и моноцитов белком HSP70 от действия LPS сохранялся в присутствии LY294002, однако значения ХЛ были значительно меньше, в чем в клетках без этого ингибитора (табл. 1 и 2). Наблюдаемая разница в ингибировании исследованных процессов при действии вортманнина и LY294002, возможно, связана с селективностью данных соединений и с разным механизмом их действия [7], т.к. LY294002 сильнее, чем вортманнин инактивирует передачу сигнала с PI3K на протеинкиназу В (PKB) [6]. Наши результаты указывают на то, что PI3K, по-видимому, участвует во внутриклеточных событиях, запускаемых взаимодействием нейтрофилов с экзогенным HSP70.

Под действием fMLP происходит фосфорилирование всех трех митоген-активируемых протеинкиназ (MAP киназ): экстраклеточных сигнал-регулируемых киназ 1 и 2 (ERK1/2), p38 киназы и c-JunN-терминальной киназы (JNK/SAPK). Как видно из результатов, представленных в табл. 1, под действием 25 мк МU0126-ингибитора ERK1/2 происходило ингибирование продукции АФК нейтрофилами, в отличие от PD98059 (1 мкМ) – ингибитора ERK1, который не оказывал влияния на генерацию АФК. Кроме того, U0126 не влиял на генерацию АФК нейтрофилами проинкубированными с HSP70. А при обработке нейтрофилов ингибитором PD98059 в присутствии HSP70 значение ХЛ увеличивалось на 25,3 %. Данные результаты указывают на то, что ERK1/2 не участвуют в fMLP-стимулируемом образовании АФК, также как и в продукции АФК при взаимодействии нейтрофилов с HSP70. При этом наблюдается сильное ингибирование продукции АФК LPS-активированных нейтрофилов ингибитором U0126 (табл. 1), что подчеркивает независимую от стимуляции fMLP роль ERK1/2 в TLR4-зависимой активации NADPH-оксидазы под действием LPS. В данном исследовании мы показали, что различные ингибиторы ERK по-разному действуют на генерацию АФК клетками в присутствии HSP70. Ингибитор ERK1/2 – U0126 – снижает значения ХЛ при предварительной обработке нейтрофилов с HSP70 и последующим добавлением LPS ниже уровня ХЛ клеток, обработанных только U0126. При этом ингибитор ERK1-PD98059 не снижает продукцию АФК в условиях предварительного инкубирования клеток с HSP70 до добавления LPS. Это может говорить о том, что защитный эффект HSP70 от действия LPS реализуется с участием ERK2.

В случае моноцитов U0126 в 2 раза снижал fMLP – стимулируемую генерацию АФК этими клетками, однако ингибитор ERK1 – PD98059 не влиял на продукцию АФК контрольными моноцитами, что может быть связано с тем, что в активации NADPH-оксидазы при стимуляции fMLP моноцитов ERK2 задействована в большей степени. U0126 и PD98059 в равной степени снижали LPS-индуцируемое образование АФК моноцитами. Возможно, что при действии LPS на моноциты в числе прочих сигнальных молекул активируется ERK1/2, что запускает сборку субъединиц NADPH-оксидазы.

Инкубирование моноцитов с PD98059 (табл. 2) практически не влияло на продукцию АФК в присутствии HSP70. Также данный ингибитор снижал интенсивность ХЛ предварительно обработанных с HSP70 моноцитов практически до значений, соответствующих значениям клеток, обработанных только с ингибитором. Однако U0126 снижал генерацию АФК моноцитами, инкубированными с HSP70 и ХЛ моноцитов, предварительно обработанных HSP70 до добавления LPS, до значений, близких к значениям ХЛ клеток, обработанных только ингибитором. Можно сделать предположение, что ERK2 вовлечена в реализацию защитного эффекта экзогенного HSP70 от действия LPS. Кроме того, в работе [6] было показано, что экзогенный HSP70 при связывании с TLR4 активирует ERK, которые, в свою очередь, ингибируют синтез внутриклеточного HSP70.

Ингибирование c-JunN-терминальной киназы JNK ингибитором SP600125 в концентрации 20 мкМ снижает ХЛ контрольных и инкубированных с LPS нейтрофилов и моноцитов (табл. 1 и 2). Кроме того, наблюдается сильное ингибирование респираторного взрыва у клеток, проинкубированных с HSP70 и у клеток, предварительно обработанных с HSP70 перед последующим добавлением LPS. Данные результаты показывают, что экзогенный HSP70 при генерации АФК фагоцитами действует на клетки с участием JNK.

Инкубирование с 0,5 мкМSB203580 – ингибитором p38MAPK – не влияло на ХЛ контрольных нейтрофилов (табл. 1), но снижало величину ХЛ контрольных моноцитов почти в 2 раза (табл. 2). При этом ингибитор p38MAPK снижал LPS-индуцированное увеличение ХЛ до уровня ХЛ клеток в присутствии этого блокатора, подтверждая важную роль p38MAPK в образовании АФК нейтрофилами и моноцитами под действием LPS. Также SB203580 снижал значения ХЛ нейтрофилов, предварительно инкубированных с HSP70 до обработки с LPS. Однако он не снижал образование АФК нейтрофилами, проинкубированными с HSP70, что может указывать на то, что p38MAPK не принимает участия в активации NADPH-оксидазы при стимуляции fMLP и генерации АФК в присутствии HSP70. Однако можно предположить, что p38MAPK участвует в защитном действии экзогенного HSP70 при активации клеток LPS.

Ингибитор NF-κB -Bay 11-7082 в концентрации 2 мкМ вызывает снижение продукции АФК нейтрофилами (табл. 1). Кроме того, Bay 11-7082 значительно снижает LPS-индуцируемую генерацию АФК, полностью ингибируя LPS-индуцируемую передачу сигнала. Bay 11-7082 значительно снижает величину ХЛ нейтрофилов, инкубированных с HSP70. Наиболее сильное ингибирование наблюдалось при комбинированном воздействии на клетки Bay 11-7082, HSP70 и LPS, что позволяет предположить, что NF-κB участвует в защитном эффекте HSP70 от действия LPS (табл. 1).Bay 11-7082 увеличивает генерацию АФК контрольными моноцитами (табл. 2), что согласуется с данными [13]. При этом также наблюдается значительное увеличение генерации АФК моноцитами в присутствии HSP70, и некоторое увеличение продукции АФК при действии LPS и в случае предварительного инкубирования клеток с HSP70 и последующего добавления LPS. Увеличение продукции АФК моноцитами в присутствии ингибитора может говорить о том, что NF-κB служит отрицательным регулятором активации NADPH-оксидазы в данной клеточной модели.

Как следует из наших результатов, в реализации защитного действия HSP70 от LPS у нейтрофилов принимает участие ERK2, а у моноцитов – ERK1/2. Кроме того, при взаимодействии экзогенного HSP70 с нейтрофилами р38MAPK не вовлечена в процесс генерации АФК, но участвует в защитном эффекте HSP70 от действия LPS, а в случае моноцитов р38MAPK задействована и в трансдукции сигнала HSP70, и в защитном эффекте HSP70.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 12-04-31331 мол_а.

Рецензенты:

Моренков О.С., д.б.н., заведующий лабораторией ИБК РАН, г. Пущино;

Чемерис Н.К., д.б.н., профессор, главный научный сотрудник ИБК РАН, г. Пущино.

Работа поступила в редакцию 27.11.2013.