Проведенные ранее исследования [1, 2, 3] выявили способность антиаритмиков II, III и IV классов – пропранолола, амиодарона и верапамила – оказывать симпатоингибирующий эффект в условиях модели центральной тахиаритмии, вызванной химической и электростимуляцией симпатоактивирующего центра вентролатеральной поверхности продолговатого мозга (ВЛПМ) кошек. Вышеперечисленные препараты вызывали разнонаправленные изменения в содержании биогенных аминов (адреналина, норадреналина, дофамина, Л-ДОФА, серотонина), были способны подавлять выработку возбуждающих и увеличивать содержание тормозных нейроаминокислот в продолговатом мозге у крыс [4, 5, 6]. При изучении влияния пропранолола, амиодарона и верапамила на рецепторные системы, принимающие участие в центральных механизмах регуляции сердечного ритма, к которым относятся мембранные рецепторы ЦНС, сопряженные с ионными каналами, установлено, что верапамил лимитирует повышение уровня Ca2+ в синаптосомах ВЛПМ, опосредованное активацией 5-HT3 типа рецепторов серотонина и NMDA типа рецепторов глутамата. Амиодарон уменьшает подъем уровня Ca2+ и Na+ в синаптосомах, связанный со стимуляцией NMDA типа рецепторов глутамата [7].

Учитывая полученные данные, представляло интерес исследовать влияние этих антиаритмиков на другое семейство мембранных рецепторов нейромедиаторов/нейромодуляторов ЦНС, локализованных в плазматических мембранах нейронов, работа которых сопряжена с активацией G-белков. Функциональная активность таких рецепторов может быть оценена путем регистрации изменений в синаптосомах концентрации вторичных мессенджеров – циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и инозитол-трифосфата (ИФ3). Функция 5-HT1 типа рецепторов серотонина и P2Y пуриновых рецепторов связана с ингибированием активности аденилатциклазы и последующим снижением внутриклеточной/ синаптосомальной концентрации вторичного мессенджера цАМФ [8]. Активация метаботропных рецепторов глутамата и 5-HT2 типа рецепторов серотонина приводит к увеличению внутриклеточного/синаптосомального содержания вторичного мессенджера ИФ3 [9]. Стимуляция β-адренорецепторов вызывает повышение внутриклеточной/синаптосомальной концентрации вторичного мессенджера цАМФ [10].

Целью исследования явилось сравнительное изучение влияния антиаритмиков различных классов – пропранолола (II), амиодарона (III) и верапамила (IV) на функциональную активность локализованных в плазматических мембранах нейронов рецепторов, сопряженных с G-белками.

Материалы и методы исследования

Везикулы плазматических мембран – синаптосомы – из ВЛПМ кошек получали методом дифференциального центрифугирования в градиенте перколла [11]. Для определения содержания цАМФ в синаптосомах использовали стандартные наборы фирмы «Amersham». Содержание ИФ3 определяли радиометрически по Griffin [12].

Активацию рецепторов осуществляли путем внесения селективных агонистов соответствующих типов рецепторов в суспензию синаптосом, выделенных из ВЛПМ. Для оценки специфичности выявленных изменений в качестве контроля использовали избирательные антагонисты/ингибиторы изученных в работе рецепторных систем (табл. 1).

Расчет доверительных интервалов экспериментальных значений и оценку достоверности различий между ними проводили с помощью параметрического t-критерия Стьюдента при уровне значимости, равном 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Влияние антиаритмических препаратов пропранолола, амиодарона и верапамила на функциональную активность 5-HT1 типа рецепторов серотонина оценивали по их действию на цАМФ-ответ синаптосом, индуцированный селективным лигандом 5-HT1 рецепторов – соединением 8-OH-DPAT. Добавление к суспензии синапотосом 8-OH-DPAT в конечной концентрации 0,5 мкМ приводило к значимому снижению базальной концентрации цАМФ в среднем на 38 %. Базальная [цАМФ]вн в контрольных пробах составила 16,0 ± 3,0 пмоль/мг белка. Избирательный антагонист 5-HT1 типа рецепторов серотонина спиперон (4 мкМ) нивелировал эффект селективного лиганда (рис. 1).

Таблица 1

Использованные в работе специфические лиганды различных типов рецепторов

Сокращения: 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (8-OH-DPAT); alpha-methyl-5-hydroxytryptamine (α-Me-5HT); D-2-amino-4-phosphonobutanoic acid (D-AP4); methyl-4-carboxyphenylglycine (MCPG).

Результаты сравнительного анализа действия пропранолола, амиодарона и верапамила на цАМФ-ответ синаптосом представлены на рис. 2.

Видно, что в этих условиях только пропранолол проявлял статистически значимую способность изменять цАМФ-ответ, опосредованный активацией 5-HT1 типа рецепторов серотонина.

Эффект антиаритмических препаратов пропранолола, амиодарона и верапамила на функциональную активность 5-HT2 типа рецепторов серотонина и метаботропный тип рецепторов глутамата изучали по их влиянию на изменение в синаптосомах концентрации ИФ3, индуцированное избирательными агонистами этих типов рецепторов – α-Me-5HT (30 мкМ) и D-AP4 (0,5 мкМ) соответственно.

Из данных, приведенных на рис. 3 и 4, видно, что все изученные вещества статистически достоверно не изменяли содержание этого вторичного мессенджера в синаптосомах. На основании полученных результатов можно предположить, что указанные типы рецепторов не принимают участия в реализации центрального действия антиаритмических препаратов на активность симпатоактивирующего центра ВЛПМ.

Рис. 1. Динамика изменения [цАМФ]вн на действие 0,5 мкМ 8-OH-DPAT в отсутствии (1) и в присутствии 4,0 мкМ спиперона (2)

Рис. 2. Влияние антиаритмических препаратов верапамила 10 мкМ (1), пропранолола 30 мкМ (2) и амиодарона 20 мкМ (3) на цАМФ-ответ, вызванный агонистом 5-HT1 типа рецепторов серотонина 8-OH-DPAT (А):* – отмечены достоверные изменения (p < 0,05)

Рис. 3. Влияние антиаритмических препаратов верапамила 10 мкМ (1), пропранолола 30 мкМ (2) и амиодарона 20 мкМ (3) на ИФ3-ответ, вызванный агонистом 5-HT2 типа рецепторов серотонина веществом α-Me-5HT, 30 мкМ (А)

Рис. 4. Влияние антиаритмических препаратов верапамила 10 мкМ (1), пропранолола 30 мкМ (2) и амиодарона 20 мкМ (3) на ИФ3-ответ, вызванный агонистом метаботропного типа рецепторов глутамата соединением D-AP4, 0,5 мкМ (А)

Исследование влияния антиаритмических препаратов пропранолола, амиодарона и верапамила на функциональную активность β-адренорецепторов основано на определении их действия на содержание в синаптосомах вторичного мессенджера цАМФ. На фоне действия избирательного лиганда этого типа рецепторов изопротеренола (10 мкМ) только пропранолол (30 мкМ) обладал способностью существенно подавлять цАМФ-ответ (рис. 5).

Рис. 5. Динамика изменения [цАМФ]вн под действием 10 мкМ изопротеренола в отсутствии (1) и в присутствии 30 мкМ пропранолола (2)

Статистически достоверные эффекты амиодарона и верапамила на этой модели не выявлены (рис. 6).

Эффект антиаритмических препаратов амиодарона, пропранолола и верапамила на функциональную активность P2Y пуриновых рецепторов изучали по их влиянию на изменения концентрации цАМФ в синаптосомах, индуцированные 1,0 мкМ АДФ. Из данных, представленных на рис. 7, видно, что только пропранолол достоверно изменял цАМФ-ответ синаптосом. Активность амиодарона и верапамила на этой модели не отмечена.

Рис. 6. Влияние антиаритмических препаратов верапамила 10 мкМ (1), пропранолола 30 мкМ (2) и амиодарона 20 мкМ (3) на цАМФ-ответ, вызванный агонистом β-адренорецепторов изопротеренолом (А):* – отмечены достоверные изменения (p < 0,05)

Рис. 7. Влияние антиаритмических препаратов верапамила 10 мкМ (1), пропранолола 30 мкМ (2) и амиодарона 20 мкМ (3) на цАМФ-ответ, вызванный агонистом P2Y пуриновых рецепторов АДФ, 1 мкМ (А): * – отмечены достоверные изменения (p < 0,05)

Таблица 2

Влияние исследованных антиаритмических соединений на функциональную активность различных типов рецепторов синаптосом ВЛПМ

Механизм реализации центрального эффекта антиаритмических препаратов возможен вследствие возникновения новых вариантов связывания эндогенных лигандов с наиболее оптимальными подтипами рецепторов, улучшения сопряжения мембранных рецепторов и G-белков, что влияет на функциональную активность рецепторов, изменяющих систему вторичных внутриклеточных посредников.

Выводы

В результате изучения влияния антиаритмических препаратов пропранолола, амиодарона и верапамила на функциональную активность рецепторов, сопряженных с G-белками выявлено, что антиаритмик II класса пропранолол оказывает угнетающее действие на функциональную активность β-адренорецепторов, 5-HT1 серотониновых рецепторов и P2Y пуриновых рецепторов, вызывая статистически достоверные изменения внутриклеточной концентрации вторичных мессенджеров (цАМФ и ИФ3) в синаптосомах ВЛПМ.

Амиодарон (III класс) оказывает статистически значимый эффект только на β-адренорецепторы симпатоактивирующего центра продолговатого мозга.

Верапамил (IV класс) не оказывает статистически значимого действия на исследованные типы рецепторов.

Влияние изученных антиаритмических препаратов на функциональную активность рецепторов, сопряженных с G-белками, может реализоваться в условиях in vivo преимущественно в форме превентивного эффекта. Основой подобного действия являются направленные изменения внутриклеточной концентрации вторичных мессенджеров – циклического аденозинмонофосфата и инозитол-трифосфата. По результатам наших исследований такое свойство наиболее характерно для антиаритмического средства II класса пропранолола.

Макляков Ю.С., д.м.н., профессор, зав. кафедрой фармакологии и клинической фармакологии, ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;

Быков И.М., д.м.н., профессор, зав. кафедрой фундаментальной и клинической биохимии, ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России, г. Краснодар.

Работа поступила в редакцию 18.02.2014.