В последнее время интенсивно исследуются сесквитерпеновые лактоны растений семейства сложноцветных (Asteraceae) и механизмы их противоопухолевого действия [7]. Противоопухолевая активность сесквитерпеновых лактонов реализуется в основном через индукцию апоптоза. Немаловажную роль в этом процессе играют влияние лактонов на клеточный редокс-статус, образование активных форм кислорода (АФК) и, как следствие, окислительные повреждения в клетке и запуск митохондриально-зависимого пути апоптоза [10]. Было показано, что сесквитерпеновые лактоны, выделенные из известного в народной медицине многих стран растения девясил высокий (Inula helenium L.), обладают выраженным антипролиферативным действием в отношении ряда культур опухолевых клеток [6]. Изоалантолактон (основной сесквитерпеновый лактон I. helenium) индуцирует апоптоз в различных опухолевых клеточных линиях. Данный эффект обеспечивается за счет регуляции белков семейства Bcl, активации ростовых факторов и каспазы-3, причем все эти процессы тесно связаны с образованием АФК [9]. В настоящем исследовании мы оценили влияние минорного сесквитерпенового лактона I. helenium – эпоксиалантолактона – и его производных на рост клеток аденокарциномы молочной железы человека и способность этих соединений индуцировать или предотвращать окислительные повреждения липидов мембран клеток.

Материалы и методы исследования

Исследуемые соединения

Эпоксиалантолактон выделяли из корней растения девясил высокий (Inula helenium L., сем. Asteraceae) по стандартной методике, препаративные количества эпоксиалантолактона получали эпоксидированием алантолактона [1]. Производные эпоксиалантолактона 1 и 2 получали реакцией нуклеофильного присоединения аминов по активированной экзометиленовой связи лактонного цикла (реакция Михаэля) (рис. 1) [2].

Реакция эпоксиалантолактона с аминами (общая методика). Смесь эпоксиалантолактона и соответствующего амина (10 %-й избыток) растворяли при перемешивании в метаноле и оставляли при комнатной температуре на ночь. По завершении реакции происходило образование продукта в виде осадка. При использовании в качестве нуклеофилов вторичных аминов были получены аминопроизводные эпоксиалантолактона 1 (15 соединений).

При проведении реакции с рядом первичных аминов, которые содержали дополнительный n- или π-донорный фрагмент, отделенный от аминогруппы углеводородным мостиком, нами были получены производные нового структурного типа – гидрированные бензо[g]фуро[4,3,2-cd]индолоны 2 [3]. Таким способом было получено 10 производных.

Строение всех полученных соединений было установлено с помощью спектральных методов и в ряде случаев подтверждено методом РСА.

Рис. 1. Получение эпоксиалантолактона и его производных

Культуры клеток

Культуру клеток человека MCF7 (ATCC® HTB22™) (аденокарцинома молочной железы) выращивали в среде EMEM (НПП ПанЭко) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone®, Thermo Scientific), 2мM L-глутамина (НПП ПанЭко) и 1 % гентамицина (ОАО Биохимик) в качестве антибиотика и инкубировали при 37 °C в атмосфере CO₂ (5 %).

Цитотоксичность

Цитотоксичность синтезированных соединений была определена по МТТ-тесту [8]. Клетки MCF7 сеяли в 96-луночный планшет (CELLTREAT™) в количестве 1∙10⁴ клеток/200 мкл и культивировали при 37 °C в атмосфере CO₂ (5 %). После 24 часов инкубации к культурам клеток были добавлены различные концентрации тестируемых соединений (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12 и 1,56 мкМ), и далее клетки культивировали в тех же условиях 48 часов. Для каждой концентрации эксперименты были выполнены в трех повторностях. Все вещества растворяли в ДМСО (PANREAC QUÍMICA S.L.U), конечная концентрация ДМСО в лунке не превышала 1 % и не была токсична для клеток. В контрольные лунки добавляли растворитель в количестве 1 %. После инкубации в каждую лунку было добавлено 20 мкл MTT (бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) (5 мг/мл) (Sigma-Aldrich) и планшеты дополнительно инкубировали в течение 2 часов. Далее из планшетов удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 100 мкл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. С помощью планшетного анализатора (Victor3, PerkinElmer) определяли оптическую плотность при 530 нм, за вычетом измеренного фонового поглощения при 620 нм. Значение концентрации, вызывающее 50 % ингибирование роста популяции клеток (IC₅₀), было определено на основе дозозависимых кривых с помощью программного обеспечения OriginPro 9.0.

Определение интенсивности перекисного окисления липидов

Перекисное окисление липидов гомогената мозга крыс определяли по модифицированному ТБК-тесту [4]. В качестве инициатора ПОЛ гомогената мозга крыс выступали ионы трехвалентного железа (FeNH₄(SO₄)2·12H₂O). Оптическую плотность регистрировали на планшетном анализаторе при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали гомогенат мозга крыс в отсутствие соединений, но с добавлением равного объёма растворителя.

Определение восстановительной активности соединений

Восстановительную активность исследуемых веществ устанавливали на основании их активности в реакции переноса электрона с использованием CUPRAC-теста [5]. В качестве вещества-стандарта использовали известный антиоксидант – тролокс. Значение тролокс-эквивалента определяли графически по величине оптической плотности с использованием калибровочного графика – концентрационной зависимости количества восстановленной меди от содержания тролокса.

Предобработка N-ацетилцистеином

Для определения роли окислительного стресса в процессе ингибирования роста клеточной линии аденокарциномы молочной железы при действии эпоксиалантолактона и его производных исследовали их цитотоксичность в присутствии N-ацетилцистеина – специфичного АФК-акцептора. Для этого в лунки с культивированными клетками MCF7 (кроме контроля) добавляли 3 мкл N-ацетилцистеина (5 мМ) (Sigma-Aldrich) в EMEM и инкубировали в течение 4 часов, после этого вносили исследуемые соединения (100 мкМ) и определяли значение IC₅₀ согласно процедуре, приведенной выше.

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что исходный эпоксиалантолактон не проявляет антиоксидантной активности в широком диапазоне концентраций, в то время как остальные синтезированные вещества эффективно ингибируют Fe³⁺ -индуцированное ПОЛ (табл. 1).

Для ряда соединений антиоксидантная активность в значительной степени может быть связана с восстановительной активностью, определяемой в CUPRAC-тесте. Это прежде всего относится к производным L05-0003, L05-5488n и L05-5488, более активным, чем тролокс, и производным L05-5272n, L05-5272st, близким по активности к тролоксу, которые оказывают и наиболее сильное ингибирование ПОЛ.

Таблица 1

Антиоксидантная активность соединений

Примечания:

* тролокс-эквивалент;

** нет влияния.

Практически все исследованные соединения обладают выраженной цитотоксической активностью. Как показали проведенные эксперименты, воздействие эпоксиалантолактоном и его производными в течение 48 часов ингибирует рост культуры клеточной линии MCF7 (табл. 2) в дозозависимом виде. Следует отметить, что цитотоксическая активность ряда аддуктов эпоксиалантолактона (соединения L05-0003, L05-6640, L05-0218, L05-6605, L05-6747) превышает активность исходного соединения в несколько раз.

Предварительная обработка N-ацетилцистеином снижает токсический эффект исследуемых соединений в разной степени (рис. 2) вплоть до практически полного подавления цитотоксического эффекта соединения L05-5272n. В случае изоалантолактона в работе [4] было показано, что предварительная обработка различных опухолевых клеточных линий N-ацетилцистеином сохраняет жизнеспособность клеток, указывая, что цитотоксическое действие на клетки осуществляется в основном через генерацию АФК.

Таким образом, можно предположить, что в основе цитотоксической активности производных эпоксиалантолактона лежат механизмы, связанные не только с продукцией свободных радикалов и влиянием на окислительные повреждения липидов. В большинстве случаев антиоксидантный потенциал этих соединений не препятствует проявлению их цитотоксичности по отношению к клеточной линии MCF7. В то же время для соединений L05-5272n и L05-5702 (структурный тип 1) участие АФК-зависимых механизмов в гибели клеток MCF7 более выражено и цитотоксический эффект этих соединений в большей степени может быть предотвращён добавлением N-ацетилцистеина.

Таблица 2

Цитотоксичность соединений в отношении культуры опухолевых клеток MCF7

Рис. 2. Выживаемость клеток MCF7, предобработанных N-ацетилцистеином, под действием исследуемых соединений

Исследование действия эпоксиалантолактона и его производных на трансмембранный потенциал митохондриий, высвобождение проапоптотических факторов из митохондрий и влияние на клеточный цикл поможет уточнить предполагаемый механизм действия полученных соединений. Вместе с тем наличие активных соединений с разными механизмами действия среди синтезированной серии аддуктов позволяет рассматривать их как основу для разработки агентов с высоким противоопухолевым потенциалом.

Работа выполнена при поддержке Программы Президиума Российской академии наук «Фундаментальные науки – медицине».

Рецензенты:

Григорьев В.В., д.б.н., заведующий лабораторией нейрорецепции, ФГБУН «Институт физиологически активных веществ» Российской академии наук, ведомственная принадлежность Федеральное агентство научных организаций (ФАНО), г. Черноголовка;

Кинзирский А.С., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией фармакологии, ФГБУН «Институт физиологически активных веществ» Российской академии наук, ведомственная принадлежность Федеральное агентство научных организаций (ФАНО), г. Черноголовка.

Работа поступила в редакцию 26.08.2014.