Разработка и исследование свойств электродов на основе новых нанобиокомпозитных материалов для современных биоэлектронных устройств (биотопливных элементов, биосенсоров, самозаряжающихся биосуперконденсаторов, и т.д.) является одним из основных направлений современной биоэлектрохимии. Использование редоксферментов как биокатализаторов, иммобилизованных на матрицах из углеродных нанотрубок и наночастиц золота, возможность использования которых в составе потенциально имплантируемых биоэлектродов была показана ранее [1, 2, 4], позволяет добиться высокой эффективности при функционировании в растворах, близких по составу к физиологическим жидкостям человека, по сравнению с катализаторами небиологической природы.

Целью данной работы стало создание и изучение особенностей функционирования в нейтральных растворах глюкозоокисляющих и кислородвосстанавливающих биоэлектродов на основе новых нанокомпозитных материалов, содержащих графен, поли (3,4–этилендиокситиофен) и редокс- ферменты, иммобилизованные на поверхности наноматериалов различной природы.

Материалы и методы исследования

Na2HPO4·2H2O, NaH2PO4·H2O, NaCl, HAuCl4·3H2O, H2SO4, LiClO4, цитрат натрия, ацетонитрил (≥ 99,9 %, ACN), анилин (≥ 99,8 %, ANI), толуол (≥ 99,8 %), желатин (GE), D–глюкоза, 3,4-этилендиокситиофен (EDOT), полиэтиленгликоль (PEG), 25 %-ный раствор глутарового альдегида (GA), тетратиафульвален (TTF), 7,7,8,8-тетрацианохинодиметан (TCNQ), тетрагидрофуран (THF) а также грибная глюкозооксидаза (GOx) из Aspergillus niger были получены из Sigma–Aldrich GmbH (США) и использовались без дополнительной очистки. Препарат билирубиноксидазы из гриба Myrothecium verrucaria (MvBOx) был любезно предоставлен компанией Amano Enzyme Inc. (Япония). Этанол (95 %) и аргон были куплены в Kemetyl AB (Швеция) и AGA Gas AB (Швеция) соответственно.

Все растворы готовились на деионизированной воде (18 МОм·см), полученной с использованием системы PURELAB UHQ II из ELGA Labwater (Великобритания).

Для синтеза нанобиокомпозитов использовались наночастицы золота (AuNP) диаметром 20 нм, графен (GR, толщина – 1,6 нм, менее 3 углеродных монослоев) и два типа многостенных углеродных нанотрубок (CNT, внешний диаметр – 20–30 нм, внутренний диаметр – 1–2 нм, длина – 0,5–2 мкм). GR был куплен в компании Graphene Supermarket (США), CNT – в Sigma-Aldrich GmbH (США). AuNP были синтезированы с использованием цитрата натрия в качестве восстановителя по методике, описанной в работе [5]. 50 мл раствора HAuCl4 с концентрацией 250 мкМ нагревали до кипения при постоянном перемешивании, затем добавляли 750 мкл водного раствора с массовой долей цитрата натрия 1 %, после чего раствор выдерживался в течение 10 мин без нагревания при постоянном перемешивании. Полученная суспензия AuNP охлаждалась до комнатной температуры и центрифугировалась при 10 000×g в течение 30 мин [10]. 98 % супернатанта удалялось, концентрат AuNP объединялся и ресуспензировался ультразвуковой обработкой.

Электрохимические измерения осуществлялись при помощи потенциостата/гальваностата µAutolab Type III/FRA2 от Metrohm Autolab B.V. (Нидерланды) с использованием трехэлектродной схемы с насыщенным каломельным электродом сравнения (SCE, 242 мВ относительно нормального водородного электрода) и платиновой проволокой в качестве вспомогательного электрода. Все значения потенциалов, представленные в работе, даны относительно SCE, если об этом не упомянуто специально.

Ультразвуковая обработка проводилась с использованием ванны Ultrasonic Cleaner XB2 от VWR International Ltd. (Великобритания). Сканирующая электронная микроскопия (SEM) осуществлялась на микроскопе высокого разрешения FEI Nova NanoLab 600 (Нидерланды).

Изготовление электродов на основе нанокомпозита PEDOT/графен

Золотая проволока диаметром 0,1 мм (Au) от компании Goodfellow (Великобритания) механически очищались полировкой на бумаге Microcloth (Buehler, Великобритания) в суспензии оксида алюминия с размером частиц 1 мкм, купленной в Struers (Дания). Далее поверхность промывалась деионизированной водой, подвергалась ультразвуковой обработке в этаноле в течение 5 минут, а затем электрохимически очищалась циклированием в 0,5 М H2SO4 в диапазоне потенциалов от – 0,2 до + 1,7 В в течение 20 циклов со скоростью развертки потенциала 100 мВ/с, затем электроды промывались водой и высушивались в потоке воздуха.

Далее на Au поверхности проводился электрохимический синтез нанокомпозита поли(3,4-этилендиокситиофен)/графен (PEDOT/GR) потенциодинамическим циклированием в диапазоне от 200 мВ до 1300 мВ (3 цикла при скорости развертки потенциала 100 мВ/с) в 0,1 М фосфатном буферном растворе (PB, рН 7,4), содержащем 20 мМ EDOT, 1 мМ PEG, 0,1 М LiClO4 и GR (2 мг графена на 5 мл раствора) [11]. Перед электрополимеризацией реакционная смесь подвергалась ультразвуковой обработке в течение 1 часа для получения устойчивой суспензии, после чего в течение 20 минут продувалась аргоном для удаления кислорода.

Изготовление биоанодов на основе GOx

Для обеспечения электронного переноса между электродом и иммобилизованной GOx на поверхности PEDOT/GR синтезировался комплекс с переносом заряда (CTC) TCNQ/TTF. Для этого электрод Au|PEDOT/GR погружался в раствор TCNQ в THF (1,2 мг/мл) и выдерживался до полного испарения растворителя. Затем электрод переносился в раствор TTF в ACN (1,2 мг/мл). После испарения растворителя электрод промывался в небольшом количестве ACN для удаления остатков непрореагировавшего TTF.

Биомодификация электродов осуществлялась нанесением 2 мл суспензии CNT, модифицированных GOx. Для получения суспензии CNT смешивались с PB (4 мг/мл), полученная смесь подвергалась ультразвуковой обработке в течение 20 минут, после чего к ней добавлялась GOx (1 мг/мл). После нанесения суспензии электрод высушивался при комнатной температуре, после чего покрывался GE (2 мкл 2,5 %-ного раствора GE в воде), высушивался, погружался в 5 %-ый водный раствор GA на 60 секунд и затем промывался водой.

SEM изображение биоанода Au|PEDOT/GR|TCNQ/TTF|CNT/GOx|GE представлено на рис. 1. Как видно из рисунка, поверхность электрода имеет зернистую структуру, длина активной области электрода составляет около 700 микрон, однако основная масса композита сосредоточена на участке в 300–400 микрон, что связано с особенностями распределения наноматериала в капле суспензии. Поверхность нанобиокомпозита равномерно покрыта слоем GE, обеспечивающим стабильность многокомпонентной структуры без ограничения транспорта субстрата через GE [3].

Изготовление биокатодов на основе BOx

Биомодификация катодов осуществлялась нанесением либо 2 мл суспензии CNT, модифицированных BOx (методика получения суспензии и модификации GE и GA аналогична таковой для GOx), либо 3 мкл суспензии AuNP с последующим высушиванием и погружением в раствор BOx (1 мг/мл) на 15 минут.

Результаты исследования и их обсуждение

Исследование биокаталитических свойств разработанных электродов проводилось в 0,1 М PB в интервале потенциалов от – 0,1 до 0,2 В при скорости развертки потенциала 10 мВ/с и от 0,7 до 0 В при скорости развертки потенциала 20 мВ/с для биоанодов и биокатодов, соответственно. Циклические вольтамперограммы (CV) биоанодов в PB, содержащем различные концентрации глюкозы, представлены на рис. 2.

 Как видно из данных рис. 2, выраженный биоэлектрокаталитический отклик с начальным потенциалом электроокисления глюкозы около – 50 мВ, был зафиксирован для разработанных биоэлектродов в PB, содержащем глюкозу, что находится в согласовании с литературными данными для системы CTC/GOx [6]. Плотность анодного биокаталитического тока возрастала с повышением концентрации глюкозы до 50 мМ и составляла 0,7 мА/см2 и 4,1 мА/см2 при потенциале 200 мВ в PB, содержащем 5 и 50 мМ глюкозы соответственно.

CV биокатодов Au|PEDOT/GR|CNT/BOx|GE в насыщенном воздухом и аргоном PB представлены на рис. 3, А. Электровосстановление кислорода начиналось при потенциале около 500 мВ, что находится в хорошем согласовании с полученными ранее результатами для BOx, иммобилизованной на AuNP [8] и бумаге из CNT [9]. Плотность биоэлектрокаталитического тока составляла 0,3 мА/см2 при 200 мВ в насыщенном воздухом PB.

Емкость полученных электродов составляла порядка 55 мФ/см2 для нанобиокомпозитов на основе CNT. При замене CNT на AuNP в составе нанокомпозита емкость возрастала до 120 мФ/см2, и биоэлектрокаталитический ток практически полностью нивелировался емкостным током. Однако иммобилизация BOx на модифицированной AuNP поверхности электродов, не содержащих нанокомпозита PEDOT/GR, приводит к созданию электродов с ярко выраженным биоэлектрокаталитическим откликом (рис. 3, Б). Возможность замены наноматериала в составе нанобиокомпозита позволяет добиться создания оптимальных поверхностей для специфической иммобилизации различных редокс ферментов.

Следует отметить легкость вариации емкости разработанных электродов как на этапе синтеза PEDOT/GR, так и на этапе создания нанобиокомпозита. Указанное свойство является важным для разработки электродов с двойной функцией генерации и накопления электрической мощности для создания гибридных биоэлектронных устройств [7].

Выводы

В результате проведенных исследований были созданы микроразмерные глюкозоокисляющие и кислородвосстанавливающие биоэлектроды на основе новых нанокомпозитных материалов с возможностью регуляции емкостных и биоэлектрокаталитических параметров. Полученные микроэлектроды могут быть использованы для создания современных биоэлектронных устройств, функционирующих в условиях, близких к физиологическим.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14–14–00530).

Авдеев Я.Г., д.х.н., ведущий научный сотрудник Лаборатории физико-химических основ ингибирования коррозии металлов Института физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН (ИФХЭ РАН), г. Москва;

Нам И.Я., д.б.н., профессор кафедры биологии естественно-географического факультета Брянского государственного университета им. академика И.Г. Петровского, г. Брянск.

Работа поступила в редакцию 05.12.2014.