В различных исследованиях показана все возрастающая во многих странах заболеваемость населения сахарным диабетом (СД), приводящая к увеличению распространенности хронических осложнений, что обусловливает высокую социальную значимость изучаемой патологии. Совершенствование диагностических и лечебных мероприятий при СД позволило более эффективно предупреждать развитие сосудистых осложнений [8, 11], в том числе с помощью средств, имеющих антиоксидантные свойства [4, 5, 14], однако до сих пор не существует единого мнения о терапевтической тактике ведения больных СД с применением препаратов с антиоксидантной направленностью, остаются не до конца разработанными принципы дифференцированного антиоксидантного лечения в зависимости от выраженности осложнений, а также не учтено влияние антиоксидантной терапии на отдельные звенья эндогенной антиоксидантной системы. Поэтому продолжается поиск и разработка новых способов коррекции дисбаланса в работе прооксидантно-антиоксидантной системы, в том числе рассматривается возможность повышения потенциала антирадикальной защиты в организме путем усиления реакций изотопного обмена, например дейтерий-протий (D/H), например при введении в пищевой рацион воды с модифицированным изотопным составом с пониженным (по отношению к природному соотношению этих изотопов) содержанием дейтерия [2, 13, 15].

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы была оценка влияния воды с пониженным содержанием дейтерия на состояние прооксидантно-антиоксидантной системы в крови и тканях внутренних органов у крыс при моделировании аллоксанового диабета и его коррекции путем снижения концентрации дейтерия.

Материалы и методы исследования

При выполнении исследования было изучено состояние прооксидантно-антиоксидантной системы у 42 крыс. Эксперимент проводили на самцах беспородных крыс, из которых по принципам парных аналогов было сформировано 3 группы животных, средней массой 220 ± 20 г: группа 1 – крысы, потребляющие дистиллированную минерализованную воду (150 ppm) и обычный (виварный) рацион (n = 14, интактные животные); группа 2 – крысы (n = 14), потребляющие дистиллированную минерализованную воду (150 ppm), у которых путем введения аллоксана (в дозе 17 мг/100 г внутрибрюшинно однократно) была создана модель экспериментального сахарного диабета (группа сравнения); 3 группа – крысы (n = 14), потребляющие дистиллированную минерализованную воду с пониженным содержанием дейтерия (40 ppm), у которых путем введения аллоксана (в дозе 17 мг/100 г внутрибрюшинно однократно) была создана модель экспериментального сахарного диабета. Эксперимент был разделен на 2 этапа: 1 этап – моделирование сахарного диабета у животных в группах 2 и 3; 2 этап – когда на протяжении 30-ти суток крысы потребляли виварный рацион и питьевую воду с различной концентрацией дейтерия по выше представленной схеме. Забор крови и органов у животных в группах 2 и 3 производили на 30-й день после моделирования аллоксанового диабета.

Определение концентрации дейтерия в полученной воде и плазме крови было проведено на импульсном ЯМР спектрометре JEOL JNM-ECA 400MHz. по методике [1]. Для определения изотопного состава лиофилизированных органов лабораторных животных использовался масс-спектрометр DELTAplus, (Finnigan, Германия) по методике [1].

При оценке интенсивности свободнорадикального окисления в плазме крови использовали метод люминол-зависимой H2O2-индуцированной хемилюминесценции, максимум вспышки хемилюминесценции (МВХЛ) и площадь хемилюминесценции (ПХЛ) измеряли на хемилюминотестере ЛТ-01 по методике [3] и выражали в условных единицах (усл. ед.) и единицах площади (ед. пл.) соответственно. Хемилюминесценцию (ХЛ) в гомогенатах тканей внутренних органов изучали на хемилюминометре «Lum-5773» (Россия), с использованием лицензионного программного обеспечения PowerGraph 3.3. Определение количества продуктов окислительной модификации проводили с помощью реакции с тиобарбитуровой кислотой по методике [7] и выражали в виде тиобарбитурового числа (ТБЧ). Исследование суммарной антиокислительной активности (САОА) проводили амперометрическим методом на анализаторе антиоксидантной активности «Яуза-01-ААА» по способу [12] и выражали в мг/л аскорбиновой кислоты. Определение SH-групп проводили на основании взаимодействия с 5,5’-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислотой [7]. Интегральную оценку функционирования низкомолекулярного звена прооксидантно-антиоксидантной системы осуществляли по способу [9]. Биохимические исследования проводили на автоматическом биохимическом анализаторе Chem Well 2900 T (USA), используя наборы реактивов Spinreact (Spain). В качестве лабораторно-биохимических показателей эндотоксикоза в плазме крови крыс определяли: альбумин, аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), креатинин, мочевина, глюкоза, билирубин. Изучение молекул средней и низкой массы (МСиНМ) в эритроцитах и плазме проводили по методике [6] и выражали в единицах оптической плотности (е.о.п.). Интегральную оценку состояния функциональной системы детоксикации проводили по способу [10] с помощью индекса эндогенной интоксикации.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в соответствии с методами, принятыми в вариационной статистике, с использованием свободного программного обеспечения – системы статистического анализа R (R Development Core Team, 2008, достоверным считали различие при р < 0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенных исследований было установлено, что в тканях органов функциональной системы детоксикации крыс наблюдалось уменьшение дейтерия при использовании в их питьевом рационе воды с модифицированным изотопным составом. У крыс, потребляющих воду с остаточным содержанием дейтерия 40 ppm, уровень дейтерия в лиофилизированной ткани сердца снизился на 12,3 %, в лиофилизированной ткани печени на 6,1 %, в лиофилизированной ткани почек уровень дейтерия снизился на 13,6 %. Данные изменения свидетельствуют об интенсивных реакциях изотопного обмена между жидкими средами организма и биологическими молекулами в тканях. При этом в тканях наблюдается более высокий уровень дейтерия (в среднем на 33–43 %), чем в плазме, что связано с небольшой скоростью реакций обмена изотопов водорода. Кроме того, на изотопный обмен в тканях, помимо воды, также существенное влияние оказывает потребляемая пища, обеспечивающая поступление питательных веществ с естественным (природным) изотопным D/H составом.

В ходе реакций изотопного обмена (D/H) в тканях может наблюдаться неравномерное распределение изотопов водорода, а также преимущественное накопление одной из его форм. Это происходит в результате термодинамической неравноценности изотопных соединений. Несомненно, замещение дейтерия протием в высокомолекулярных соединениях не окажет существенного влияния на их термодинамическое состояние. Тем не менее за счет обмена изотопов водорода в легко диссоциирующих группах (гидроксильных (–ОН), тиоловых (–SH), первичных и вторичных аминогрупп (–NH2, = NH)) активных и аллостерических центров ферментов в ходе осуществления реакций биокатализа может изменяться скорость каталитических процессов в результате снижения энергии активации переходных состояний молекулы. Все это может приводить к повышению интенсивности биохимических процессов.

При моделировании аллоксанового диабета у крыс наблюдали повышение уровня глюкозы в 2,2 раза, сопровождающееся возрастанием активности ферментов, характеризующих цитолитические процессы (АСТ, АЛТ), увеличением концентраций креатинина, билирубина и мочевины (таблица). При этом по данным хемилюминесценции было выявлено достоверное усиление интенсивности процессов свободнорадикального окисления в крови (на 73,2 %, р < 0,05) и внутренних органах: сердце (на 58,4 %), печени (на 32,9 %), почке (на 9,3 %). На фоне столь выраженных метаболических нарушений выявлен значительный дисбаланс функционирования прооксидантно-антиоксидантной системы у крыс в группе 2, который характеризовался повышением: количества продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в плазме крови на 81,2 %; базального количества продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в эритроцитах на 35,7 %; количества продуктов окислительной модификации (Fe2+-индуцированных) в эритроцитах на 64,0 %, что превышало аналогичные показатели в группе 3 (таблица), получающей воду с пониженным содержанием дейтерия. В группе 3 аналогичные показатели, отражающие выраженность процессов пероксидации, были меньше, чем в группе 2 на 11,3 % (количество продуктов окислительной модификации в плазме), 7,0 и 7,2 % (базальное и Fe2+-индуцированное количество продуктов окислительной модификации соответственно в эритроцитах).

Показатели прооксидантно-антиоксидантной системы и функциональной системы детоксикации при экспериментальном сахарном диабете

Примечание. * – p < 0,05 по сравнению с показателями группы 1 (контрольная).

При этом было выявлено повышение интенсивности хемилюминесценции плазмы крови: максимума вспышки на 73,2 и 52,6 % в группах 2 и 3 соответственно в сравнении с контрольной группой, тогда как суммарный показатель низкомолекулярного звена антиоксидантной системы плазмы, измеренный с помощью амперометрического метода, был снижен на 33,5 и 25,7 % в группах 2 и 3 соответственно, что указывает на более существенный дисбаланс соотношения прооксидантных и антиоксидантных факторов у животных с аллоксановым диабетом, получавших воду 150 ppm (по дейтерию), в сравнении с крысами, потребляющими воду 40 ppm. Количество тиоловых групп у крыс с моделью аллоксанового диабета также было снижено на 32,1 и 29,3 % в группах 2 и 3 соответственно, что подтверждает нарушение регенерации низкомолекулярных антиоксидантных факторов у крыс в этих группах в условиях окислительного стресса, обусловленного развитием аллоксанового диабета.

Интегральный показатель функционирования низкомолекулярного звена прооксидантно-антиоксидантной системы (коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов) в группе 2 был на 17,9 % выше, чем у крыс в группе 3, что подтверждает перспективность использования воды с пониженным содержанием дейтерия при комплексной коррекции нарушений в работе антиоксидантной системы, наблюдающихся при развитии диабета. При этом наблюдалось уменьшение индекса эндогенной интоксикации в группе 3 на 27,1 % в сравнении с показателями группы 2, что указывает на повышение функциональной активности органов детоксицирующей системы у крыс, потреблявших воду с пониженным содержанием дейтерия.

Выводы

Таким образом, полученные данные, характеризующие состояние прооксидантно-антиоксидантной системы, свидетельствуют о значимой роли дисбаланса в ее работе при развитии метаболических нарушений у крыс с аллоксановым диабетом, в том числе и при формировании патологических изменений в органах детоксикации. При этом отмечено корригирующее влияния воды с пониженным содержанием дейтерия (40 ppm) на состояние как прооксидантно-антиоксидантной, так и детоксицирующей систем у крыс с аллоксановым диабетом, что позволяет рекомендовать применение реакций изотопного обмена при комплексной коррекции нарушений метаболизма, связанных с недостаточностью инсулина. В целом применение в комплексном лечении воды с пониженным содержанием дейтерия позволило уменьшить выраженность нарушений в работе антиоксидантной системы и снизить интенсивность процессов свободнорадикального окисления в крови и тканях внутренних органов, что сопровождалось менее значимым накоплением эндотоксических субстанций в плазме крови.

Гайворонская Т.В., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Краснодар;

Быков И.М., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фундаментальной и клинической биохимии, ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Краснодар.

Работа поступила в редакцию 10.03.2015.