Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

BIOCONVERSION OF A FAT INDUSTRY WASTE THE LIPASE OF YEAST YARROWIA LIPOLYTICA

Репин П.С., Корнеева О.С., Карманова О.В.
Выбраны оптимальные условия гидролиза отходов масложировой промышленности дрожжевой липазой Yarrowia lipolytica при низком содержании воды и одновременном присутствии в реакционной смеси оксида кальция, позволяющие использовать продукты гидролиза в технологии производства резино-технических изделий.
Optimum conditions of hydrolysis by Yarrowia lipolytica yeast lipase of the fat industry waste was studied at the low maintenance of water and presence at a reactionary mix the calcium oxide. It allows to use hydrolysis products in the technology of rubber wares. Keywords: lipase, enzyme hydrolysis, fat-contained waste, emulsion «water in fat»

Липолитические ферменты широко применяются в различных отраслях промышленности. Однако их использование ограничивается гидролизом субстрата, представляющего собой водную эмульсию жира. Это связано с тем, что при гидролизе эмульсии типа «жир‒вода» дисперсионная среда берется в избытке для достижения практически полной степени деструкции глицеридов за счет смещения равновесия в сторону образования конечных продуктов. Получаемые при этом гидролизаты представлены в виде водного раствора, и для их дальнейшего использования необходимы стадии отделения воды, сушки, а также очистки сточных вод, что нерентабельно. Литературных данных, описывающих применение липаз для расщепления триглицеридов в условиях обратной эмульсии, крайне мало.

Биодеструкция жира при использовании эмульсии «вода‒жир» позволит избежать вышеуказанных недостатков, а также осуществить переработку крупнотоннажных отходов масложирового производства, содержащих кроме масел и жиров минеральные компоненты [3], препятствующие эмульгированию глицеридов в воде. Полученные при этом гидролизаты ‒ моно-, ди- и триацилгилцериды, жирные кислоты ‒ могут быть в дальнейшем использованы в производстве резино-технических изделий (РТИ)в качестве вторичных активаторов вулканизации, диспергаторов ингредиентов и мягчителей резиновых смесей и др. [4-6].

Основным требованием к применяемым в технологии РТИ добавкам является их влажность, значение которой не должно превышать 0,5‒1 %, в связи с чем была поставлена цель: подбор оптимальных условий биодеструкции отходов масложировой промышленности с низким содержанием воды (до 10 %). Для этого в реакционную среду дополнительно вносили оксид кальция [4].

Материалы и методы исследования

В работе использовали отход стадии дополнительного саломаса и липазу дрожжей Yarrowia lipolytica (ГосНИИГенетика) со степенью очистки Г10х, химические реактивы марок: х.ч., ч.д.а., ч.

Гидролиз проводили в лабораторных реакторах объемом 15 см3. Предварительно усредненную навеску отхода 10 г (содержание жира 50‒55 % мас.) помещали в реактор, где при 40°С и постоянном перемешивании с использованием лабораторной двухлопастной мешалки расплавляли до однородной массы. Далее в реактор добавляли CaO в виде мелкодисперсного порошка. Фермент растворяли в фосфатно-цитратном буферном растворе (pH 7,0) и, предварительно нагрев до 40°С, вносили в реакционную смесь. Перемешивание осуществляли в течение первых 10 минут. Дальнейшее перемешивание при данной температуре затруднялось из-за образования в смеси более высокоплавких продуктов: моно- и диацилглицеридов. Гидролиз продолжали в статических условиях при комнатной температуре (23±3°С) в течение 1-5 суток.

Об эффективности протекания процесса судили по кислотному числу, характеризующему содержание свободных жирных кислот и определяемому по ГОСТ 52 110-2003 с предварительной экстракцией жировой фазы смесью растворителей (диэтиловый эфир и этиловый спирт в соотношении 2 : 1), по массовому количеству кальциевых солей жирных кислот, характеризующему содержание связанных жирных кислот и определяемому по ГОСТ 5480-59 с предварительной экстракцией карбоксилатов горячим толуолом. Общий выход жирных кислот (сумма свободных и связанных в кальцевые соли кислот) в результате гидролиза оценивали по объему соляной кислоты (0,05 моль/дм3, ацетоновый раствор), пошедшему на титрование избытка добавленного спиртового раствора KOH (2 моль/ дм3, спиртовой раствор) в ацетоновой среде в присутствии тимолфталеина.

Оценку липидного состава проб осуществляли методом тонкослойной хроматографии. Анализ проводили на пластинках марки «Sorbfil-ПТСХ-АФ-А» (100×100 мм). Система растворителей: петролейный эфир (40-70) : диэтиловый эфир : уксусная кислота = 80 : 20 : 1 [2]. Проявление хроматограмм осуществляли в эксикаторе, насыщенном парами йода. Проявленные хроматограммы сканировали при разрешении 600 dpi (точек на дюйм). Обработку хроматограмм проводили с использованием программы «ТСХ-Менеджер 4.0.1».

Результаты исследования и их обсуждение

Подбор концентраций и дозировок компонентов для проведения ферментативного гидролиза осуществляли по методу латинского квадрата 4×4 [1]. Рассматривалось влияние следующих факторов: фактор «A» ‒ масса вносимого в реакционную среду оксида кальция, фактор «B» ‒ объем вносимой воды (объем буферного раствора), фактор «C» ‒ дозировка липазы. Об эффективности протекания гидролиза судили по общему выходу жирных кислот (в % от теор.) через двое 2 суток проведения процесса. Результаты эксперимента обрабатывались на ПЭВМ с использованием метода регрессионного анализа (таблица).

Из таблицы следует, что все из исследуемых факторов оказывали влияние на степень ферментативного гидролиза жира в заданных условиях. Увеличение дозировки оксида кальция способствовало росту выхода конечного продукта гидролиза. Однако увеличение концентрации CaO свыше 20 % к массе отхода не позволяло получить однородную массу в заданных условиях, поэтому за оптимальное значение приняли дозировку оксида 20 % к массе отхода. Меньшее влияние на процесс оказывал другой из исследуемых факторов - дозировка воды. Зависимость выхода жирных кислот от фактора «B» носила нелинейный характер, и при увеличении дозировки воды с 9 до 12 % к массе отхода выход кислот возрастал менее чем на 1 %. Учитывая цель настоящего исследования ‒ проведение ферментативного гидролиза при низком содержании воды, за оптимальную концентрацию приняли 9 % воды к массе отхода. Наибольшее влияние на выход жирных кислот оказывал фактор «C». Увеличение количества вносимого фермента в реакционную смесь с 7 до 14 ед. Е/ г жира приводило к возрастанию выхода жирных кислот более чем в 1,5 раза. Дальнейшее повышение концентрации липазы с 14 до 21 ед. Е/г жира увеличивало выход продукта гидролиза лишь на 10 %, что говорит о нецелесообразности повышения дозировки фермента свыше 14 ед. Е/г жира.

Выход жирных кислот в зависимости от исследуемых факторов 

Наименование фактора

Номер уровня

Значение фактора

Значение функции отклика

(общий выход жирных кислот,

в % от теор.)

Фактор «A» - дозировка CaO,
в % к массе отхода

1

5

33,3

2

10

35,8

3

15

41,7

4

20

48,4

Фактор «B» - дозировка H2O,
в % к массе отхода

1

3

37,9

2

6

39,7

3

9

41,6

4

12

42,1

Фактор «C» - дозировка липазы,

ед. Е/г жира

1

7

27,1

2

14

41,0

3

21

45,4

4

28

45,5

Для определения продолжительности гидролиза отхода исследовали динамику процесса в течение 5 суток при комнатной температуре в статическом режиме (рис. 1). Реакционная смесь содержала: 20 % CaO и 10 % H2O к массе отхода. Дозировка липазы дрожжей Yarrowia lipolytica ‒ 14 ед. Е/г жира.

1

Рис. 1. Динамика изменения состава реакционной массы:
1 ‒ общий выход жирных кислот; 2 ‒ содержание связанных в кальциевые соли жирных кислот; 3 ‒ содержание свободных жирных кислот

Общий выход жирных кислот в гидролизате (рис. 1) достигал максимального значения через двое суток проведения гидролиза. Далее в реакционной смеси происходило образование только карбоксилатов кальция при одновременном снижении концентрации свободных жирных
кислот.

Для оценки изменения липидного состава реакционной смеси отбор проб осуществляли через 1, 3 и 5 суток после начала гидролиза. Как показывают денситограммы проб (рис. 2), промежуточными продуктами процесса являлись 1,2-диацилглицериды и О-диалкилмоноглицериды. Последние, вероятно, образовались в результате взаимодействия высших жирных спиртов, присутствующих в отходе, и моноацилглицеридов, образующихся в результате гидролиза. Максимальное количество данного продукта отмечено на третьи сутки проведения гидролиза, после чего количество его в среде заметно снижалось. Площадь пика, соответствующая жирным кислотам на третьи и пятые сутки гидролиза, оставалось неизменной, что согласуется с представленными ранее данными
(рис. 1). Высота пика триглицеридов снижалась в течение всего периода проведения процесса.

Полученный в результате ферментативного гидролиза отхода гидролизат сушили при 60°С в течение 60 минут. Влажность полученного порошка не превышала 1 %. Продукт был испытан в резиновых смесях на основе этиленпропиленового каучука марки «DUTRAL TEP» в качестве технологической добавки. Содержание его в опытных образцах резин составляло 2‒5 мас. ч. на 100 мас. ч. каучука дополнительно к серийному рецепту.

Результаты испытаний показали, что опытная технологическая добавка в исследуемом диапазоне концентраций оказывала пластицирующее влияние на резиновые смеси. Вязкость опытных образцов снижалась до 138‒134  усл. ед. по Муни по сравнению с серийным (143 усл. ед.). Одновременно наблюдалось снижение времени достижения оптимума вулканизации с 12,24 минут до 11,62, что свидетельствует об активирующем влиянии исследуемого продукта на вулканизационные характеристики резиновых смесей. Также отмечено некоторое улучшение упруго-прочностных свойств резин с исследуемой добавкой: условная прочность при растяжении составляла 13,6‒15,8 МПа при значении данного показателя для серийной резины 13,5 МПа; увеличение относительного удлинения при разрыве возросло приблизительно на 15 %; сопротивление раздиру увеличилось с 41 кН/м у серийного образца до 47 кН/м у опытного. По-видимому, это связано с проявлением диспергирующего эффекта предложенной технологической добавки и улучшением распределения наполнителей и компонентов вулканизующей группы в ее присутствии.

Заключение

Проведенные исследования позволили установить, что максимальный выход жирных кислот и их солей в результате гидролиза отхода стадии дополнительного отбеливания саломаса липазой дрожжей Yarrowia lipolytica наблюдается при внесении фермента в количестве 14 ед. Е/г жира и содержании в реакционной смеси 20 % оксида кальция и 9-12 % воды к массе отхода в течение 4‒5 суток при комнатной температуре в стационарном режиме.

Полученный гидролизат, содержащий свободные жирные кислоты и их соли, моно-, ди- и триглицериды, после сушки можно рассматривать как технологическую добавку, выполняющую функции диспергатора, мягчителя и активатора вулканизации, для резиновых смесей на основе этиленпропиленового каучука.

2

Рисунок 2. Характеристика изменения липидного состава реакционной смеси

через 1, 3 и 5 суток гидролиза

Список литературы

  1. Ахназарова С.Л., Кафаров В.В. Методы оптимизации эксперимента в химической технологии : учеб. пособие для хим.-технол. спец. вузов. ‒ 2-е изд., перераб. и доп. ‒ М. : Высш. шк., 1985. ‒ 327 с.
  2. Лабораторный практикум по химии жиров / Н.С. Арутюнян, Е.П. Корнена, Е.В. Мартовщук и др.; под ред.проф. Н.С. Арутюняна и проф. Е.П. Корненой. ‒ 2-е изд., перераб. и доп. ‒ СПб. : ГИОРД, 2004. ‒ С. 145-148.
  3. О´Брайен, Р. Жиры и масла. Производство, состав, свойства, применение; пер. с англ. 2-го изд. В. В. Широкова, Д. А. Бабейкиной, Н. С. Селивановой, Н.В. Магды. ‒ СПб. : Профессия, 2007.‒ 752 с.
  4. Патент РФ № 2015161, 30.06.94.
  5. Рахматулина А.П. Влияние стеариновой и олеиновой кислот на молекулярно-топологическое строение резин на основе бутадиен-метилстирольного каучука / А.П. Рахматулина, Ю.А. Ольхов, Р.А. Ахмедьянова, А.Г. Лиакумович // Каучук и резина. ‒ 2005. ‒ №3. ‒ С. 17-22.
  6. Шутилин Ю.Ф. Справочное пособие по свойствам и применению эластомеров : монография. ‒ Воронеж: ВГТА, 2003. ‒ 871 с.

Рецензенты:

Лукин Алексей Леонидович, д.с.-х.н., профессор, зав. кафедрой биохимии и микробиологии, Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный аграрный университет им. К.Д. Глинки» Министерства сельского хозяйства РФ;

Кузнецов Вячеслав Алексеевич, д.х.н., доцент, кафедры химии высокомолекулярных соединений и коллоидов государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» Министерства образования и науки РФ.