Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

EFFEСТ OF THE «MURINE» ТОХIN FROM YERSINIA PESTIS ON ТНЕ ATP-ASE ACTIVITY IN EXRERIMENTAL ANIMALS

В.С. Каграманов, О.С. Бурша, Л.Е. Асеева
Data are presented оп the effect of the «murine» toxin (МТ) form Yersinia pestis оп the АTPase activity in cells of experimental animals. It has been shown that the data оn the blood electrolyte contents, total ATPase activity and Na (+)-, К(+)-, Са( ++ )-dependent ATPase activity induced bу sublethal МТ doses (0,5-1 mcg) indicate development of hypoxis state, specifically, metabolic acidosis in experimental animals.

Кислород является обязательным и необходимым элементом для многочисленных биохимических реакций, протекающих в важных метаболических путях клетки. При недостаточности кислорода нарушается скорость метаболических реакций в организме, что приводит к нарушению функции клеток и органов. Roubin [6] нарушение утилизации О2 клетками обозначает термином «дизоксия». Автор различает три вида дизоксии: 1) гипоксическая дизоксия, возникающая при снижении количества поступающего в ткани О2, т. е. пониженное снабжение или транспорт О2; 2) нормоксическая дизоксия, при которой снабжение и транспорт О2 нормальный, но нарушается утилизация О2 на уровне субклеточных органелл (митохондрии, микросомы, пероксисомы, лизосомы, ядро и др. органеллы); 3) гипероксическая дизоксия – нарушение функции клетки при повышенном содержании О2 или повышенной его активности (свободно-радикальные повреждения, нарушение разложения Н2О2 – перекисные повреждения и др.).

Кислородная недостаточность, возникающая при чумной интоксикации, связана с нарушением метаболических и гуморально- метаболических факторов регуляции.

Патологические состояния, возникающие в организме при кислородном голодании, проявляются на различных уровнях: на уровне целостного организма, различных органов и систем, клеточном, субклеточных фракций, молекулярном.

Среди молекулярных клеточных изменений основное место занимают нарушения процессов энергообразования и поражения клеточных мембран.

Одним из индикаторов структурно-функционального состояния плазматических мембран является АТФ-аза.

Повсеместно встречающийся в плазматической мембране (Na+ + K+) – насос – это АТФ-аза. Натриево-калиевые насосы, имеющиеся в плазматических мембранах всех животных клеток, работают по принципу антипорта, активно качая Na+ из клетки, а K– в клетку против градиентов концентраций (в случае же ионов Na+ и против электрического градиента). Избирательная проницаемость биологических мембран по отношению к простым ионам создает значительные различия в ионном составе внутреннего содержимого клетки и внеклеточной жидкости. Так, внутриклеточная концентрация (мМ) Na+ – 5–15, K+ – 140, Mg2+ – 30, Са2+ – 1–2, внеклеточная концентрация – 145, 5, 1–2 и 2,5–5 соответственно.

Градиенты концентраций ионов Na+ и K+, поддерживаемые натриево-калиевым насосом, ответственны не только за мембранный потенциал клетки, но и за регуляцию клеточного объема, а также за активный транспорт сахаров и аминокислот.

Кроме того, Na, K АТФ-аза осуществляют контроль за дыханием, регуляцию внутриклеточного значения рН и трансмембранного переноса сахаров, аминокислот, нейротрансмиттеров.

Важная роль (Na+ + K+) АТФ-азы в регуляции клеточного объема подтверждается тем фактом, что при обработке животных клеток уабаином (С1-строфантин), ингибирующим (Na+ + K+) АТФ-азу, они разбухают и разрываются. Следует отметить, что в большинстве животных клеток основная роль в предотвращении разрыва из-за осмотического давления принадлежит (Na+ + K+) АТФ-азе.

Значительный шаг в понимании молекулярного механизма натриево-калиевого насоса был сделан в 1957 году, когда обнаружилось, что для оптимальной активности фермента, гидролизующего АТФ до АДФ и фосфата, требуются Na+ + K+.

Однако в плазматических мембранах эукариотических клеток обнаруживаются ферменты, действующие в обратном направлении: вместо гидролиза АТФ, обеспечивающего транспорт ионов (как в случае (Na+ + K+) АТФ-азы и Са 2+ – АТФ-азы), они катализируют синтез АТФ из АДФ и фосфата. Поэтому такие ферменты называются АТФ-синтетазами. Во всех случаях ферменты могут работать в обоих направлениях в зависимости от условий: они могут гидролизовать АТФ и качать Н+ через мембрану во внутреннее пространство или же могут синтезировать АТФ при прохождении потока ионов Н+ через молекулы ферментов в обратном направлении.

В литературе отсутствуют данные о механизмах регуляции активности данного фермента при экстремальных воздействиях.

Цель данной работы заключалась в изучении активности АТФ-азы клеток экспериментальных животных при воздействии «мышиного» токсина (МТ) чумного микроба.

Материалы и методы: изучение активности АТФ-азы проводили на спленоцитах монгольских песчанок (целых и мембранных фракций клеток). Селезенки забирали у декапитированных животных и освобождали от эритроцитов промыванием 0,84 % раствором NH4Cl на холоде. Для выделения мембранных фракций клетки разрушали при 4 оС на ультразвуковом дезинтеграторе PY-100 MSE 150W (Англия) с помощью цилиндрического стержня 9,5 мм при частоте колебаний 20 кГц и амплитуде 10–12 мкм. Время озвучивания составило 3 мин. Клеточные фракции выделяли методом дифференциального центрифугирования. Полученные мембранные фракции исследовались на содержание белков, обладающих АТФ-азной активностью.

Пробы содержали: 25 мМ трис-HCl буфер; рН 7,4; 100 мМ KCL; 65 мМ NaCl; 5 мМ MgCl2 и 0,1 М АТФ. Активность измеряли в мкМ Рн на мг белка. Фосфор определяли по Фиске и Суборроу [3], белок – по Лоури [5] и методом дифференциальной спектрометрии [4].

Количество АТФ измеряли хемилюминесцентным методом с помощью стандартного набора фирмы Calbiochem (США).

Изменение АТФ-синтетазной активности мембранных фракций спленоцитов монгольских песчанок в наших экспериментах определяли параллельно двумя методами [2]. В одних опытах использовали рН-индикатор феноловый красный (30 мкМ), в других – синтетазную активность определяли в присутствии АТФ-регенирирующей системы.

Показания электролитного состава крови: Na+ К+ Са++ и Cl- получены нами на газовом анализаторе кислотно-щелочного равновесия Ciba – Korning 860 (Англия).

За 18–20 часов до получения крови животным вводили 0,5 мл «мышиного» токсина (0,5–1 мкг), контрольным – по 0,5 мл физиологического раствора. МТ получен из штамма кишечной палочки DН, несущей рекомбинантную плазмиду с клонированным геном токсина. Молекулярная масса токсина, по данным электрофореза, составила 61 кД, Ld50 очищенного препарата составляла для белых мышей 1,0–1,2 мкг по белку.

Результаты и обсуждение

При определении электролитного состава крови у экспериментальных животных установлено, что содержание ионов Na+ при введении «мышиного» токсина чумного микроба 0,5–1 мкг имеет тенденцию к увеличению, а К+ увеличивается в 2,05, 1,4 1,06 у белых мышей, монгольских песчанок и морских свинок соответственно (таблица 1).

Таблица 1

Содержание электролитов крови животных под влиянием «мышиного» токсина чумного микроба (мг/%)

Вид животных

«Мышиный» токсин чумного микроба М±м

Na+

К+

Са++

Cl-

Белые

мыши

n=12

К

137,5±14,6

5,2±0,6

0,97±0,085

105±9,4

О

138,2±13,8

10,7±1,2

0,61±0,07

87±9,2

Монгольские

песчанки

n=7

К

119,3±10,9

4,2±0,38

1,37±0,28

118±11,7

О

128,9±12,4

6,03±0,7

1,09±0,09

94±10,1

Морские

свинки

n=7

К

134,7±13,7

5,8±0,64

1,20±0,12

97±9,3

О

136,8±14,1

6,2±0,66

1,12±0,09

97±9,2

 

Смещение ионного равновесия происходит, по-видимому, из-за снижения активности Na, К-АТФ-азы в проведенных нами экспериментах (таблица 2).

Таблица 2

Активность АТФ-азы в клетках монгольских песчанок под влиянием токсина чумного микроба (мкМ Рн /мг белка/час)

АТФ-аза

Клетки (n=8) и цитозольная фракция

К

Опытные пробы

%

АТФ-аза

(общая)

n=6

целые клетки

41,2

28,2

68 %

цитозольная

фракция

32,8

23,1

70,4 %

Сa++, Mg++

АТФ-аза

Целые клетки

27,5

26,2

95,2 %

цитозольная

фракция

24,3

21,8

89,7 %

Na+, K+

АТФ-аза

Целые клетки

13,7

2,0

14,6 %

цитозольная

фракция

8,5

1,3

15,3 %

 

Под влиянием МТ чумного микроба отмечалось снижение АТФ-азной активности как в целых клетках, так и мембранах. При добавлении в инкубационную среду сердечного гликозида – строфантина С (уабаин) в концентрациях 0,4•10-4 М – 10-6 М Na, К-АТФ-аза почти полностью ингибировалась.

Согласно литературным данным [1] концентрация ионов Са2+ в цитозоле эукариотических клеток поддерживается на гораздо более низком уровне (<10-7 М). Поток ионов Са2+, устремляющийся по столь крутому градиенту в ответ на внесение сигнала, – важный способ передачи таких сигналов через плазматическую мембрану внутрь клетки. Градиент частично поддерживается с помощью существующих в плазматической мембране Са2+-насосов, активно выводящих Са2+ из клетки. Известно, что некоторые из таких насосов представляют собой АТФ-азы. Кальциевая АТФ-аза осуществляет сопряженный с гидролизом АТФ перенос ионов Са2+.

Что касается Са++ АТФ-азы в наших экспериментах на спленоцитах монгольских песчанок под влиянием «мышиного» токсина чумного микроба, то они не отличались от контрольных. ИоныCl- уменьшаются как у монгольских песчанок, так и у белых мышей и морских свинок при введении им МТ. Изменение электролитного состава крови соответствует общей направленности сдвигов показателей кислотно-щелочного гомеостаза крови. При снижении рН увеличивается содержание ионов Na+ и К+ в крови, а из-за повышения СО2 наступает повышение Н2СО3 , растворенного СО2и НСО3, а также снижается содержание хлоридов (Cl-).

Под влиянием токсина отмечалось снижение АТФ-синтетазной активности до 18–15,5 % по сравнению с контролем (таблица 3).

Таблица 3

АТФ-синтетазная активность (в нМ/мг/мин) мембранных фракций спленоцитов монгольских песчанок под влиянием токсина чумного микроба (М±m)

Проба

Контроль

Токсин

Р

С индикатором феноловым красным (n=7)

615±102

520±90

<0,5

С АТФ – регенерирующей системы

458±76

387±62

<0,5 %

 

Следует учесть, что мембранные препараты были гетерогенны и состояли как из «сопряженных», так и из «несопряженных» структур, из которых одни были способны к синтезу АТФ и генерации электрохимического потенциала при гидролизе АТФ, а другие характеризовались свободной проницаемостью мембран для Н+ и не синтезировали АТФ, а добавление токсина чумного микроба, вероятно, приводило к включению в гидролиз АТФ и АТФ-аз, ассоциированных с «сопряженными» участками.

Что касается количественного содержания АТФ, то токсин Yersinia pestis снижает количество растворимой клеточной АТФ почти наполовину (58 %) по сравнению с контрольными клетками.

Процесс окислительного фосфорилирования в клетках катализируется сложной полиферментной системой, включающей АТФ-синтетазный комплекс и локализованные на мембране компоненты дыхательной цепи, которые участвуют в генерации электрохимического потенциала ионов водорода. Внутренняя мембрана во всех клетках выполняет одинаковую функцию, обеспечивая сопряжение окисления с синтезом АТФ. Синтез АТФ осуществляется за счет энергии мембранного потенциала и сопряжен с трансмембранным переносом Н+.

Таким образом, у экспериментальных животных под влиянием МТ (сублетальных доз – 0,5–1 мкг) по данным электролитного состава крови, активности АТФ-азы общей, Na+, К+, Са++-зависимой можно диагностировать гипоксическое состояние, в частности, метаболический ацидоз.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1.  Альбертс, Б. Молекулярная биология клетки / Б. Альбертс, Д. Брей, Дж. Льюис и др. – Т. 2. – С. 168.

2.  Васильева, Е.А. Биохимия / Е.А. Васильева, М.В. Панченко, А.Д. Виноградов. – 1989. – Т. 54, № 9. – С. 1490.

3.  Фриске–Суббароу // J. Biol. chem. – 1925, V. 66. – P. 375.

4.  Ehresmann B., Imbault., Wiel J.H. // Analyt. Biochem. – 1973, V. 54, № 2. – P. 454.

5.  Lowry O.H., Rosenbrough N.Y., Farr A.L., Randal R.J. // J. Biol. chem. – 1951,V. 193. – P. 265.

6.  Robin, E.D. Of men and mitochondria: coping with hypoxia disoxia: The 1980 J. Burns amberson secture // American rivien of respiratory disease. – 1980, V. 122, № 4. – P. 517.