В основе эффективного лечебного действия антибактериальных препаратов лежат высокая чувствительность к ним возбудителей заболеваний, возможность создания терапевтически значимой концентрации антибиотика в очаге поражения, минимальное побочное действие на организм больного. В настоящее время общепризнанным является увеличение количества штаммов микроорганизмов, резистентных к антибиотикам, а также нарастание патогенных свойств сапрофитных и потенциально патогенных микроорганизмов, что определяет необходимость создания новых, более эффективных антибактериальных препаратов [1]. Поиск путей преодоления резистентности микроорганизмов к антибиотикам является актуальной задачей современной фармакологии. Одним из возможных решений данной проблемы является наделение существующих антибиотиков новыми физико-химическими свойствами, различными методами модификации [2]. Развиваемая в ИХТТМ СО РАН, твердофазная, не требующая участия жидких фаз, механохимическая технология получения супрамолекулярных систем лекарственных веществ с веществами - «носителями» продемонстрировала свою эффективность для повышения их фармакологической активности и безопасности [3, 7]. Диоксид кремния (SiO2) рассматривается как перспективный биосовместимый, биодеградируемый материал - «носитель», не обладающий цитотоксичностью, способный пенетрировать через мембраны различных клеток, для создания на его основе лекарственных препаратов с контролируемым тканеспецифическим или интрацеллюлярным высвобождением [10].
Целью данного исследования являлась сравнительная оценка антибактериальной активности цефалоспоринов, модифицированных механохимической обработкой смесей антибиотик/SiO2, сопровождающейся иммобилизацией антибиотика на наноструктурированных частицах SiO2, с их официнальными формами in vitro.
Материал и методы исследования
Модификация цефалоспориновых антибиотков III-IV поколения - цефтазидима, цефотаксима, цефепима, цефтриаксона, осуществлялась механической обработкой смесей антибиотиков и коллоидного диоксида кремния (энтеросорбент «Полисорб» (ЗАО «Полисорб», Россия)) в шаровой мельнице (энергонапряженность 1g) в массовых соотношениях антибиотик/SiO2 - 30:1. Гранулометрический состав водных суспензий исходного наноструктурированного SiO2 (нано-SiO2) и его композиций с антибиотиками определяли на лазерном гранулометре Micro-Sizer 201 (Россия). Концентрации водных растворов антибиотиков исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Agilent 1200 (США). Степень сорбции антибиотика коллоидным диоксидом кремния оценивали по количеству антибиотика, десорбировавшегося в водную фазу из SiO2, осажденного центрифугированием водных суспензий механохимически полученных композиций.
Изучение антимикробной активности антибиотиков производилось in vitro, на основании динамики роста культуры ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов в мясо-пептонном бульоне (МПБ). Определение минимальной ингибирующей дозы (МИК) проводилось методом двукратных серийных разведений. Антибактериальную активность антибиотиков оценивали в диапазоне концентраций от 0,03 до 128 мкг/мл. Препараты предварительно разводили в физиологическом растворе хлорида натрия. Тестирование роста бактерий осуществляли в 5 мл каждого разведения антибиотика с конечной концентрацией микроорганизмов 5⋅105 микробных тел/мл. В соответствии с рекомендациями [4] контроль роста в присутствии растворителя не производился. В качестве контроля роста бактерий в МПБ использовали образцы, содержащие среду и тестируемые штаммы без антибиотиков. Культуры помещали в термостат на 24 часа при 37 °С, после чего учитывали наличие или отсутствие роста микроорганизмов и определяли минимальную ингибирующую концентрацию (МИК), то есть наименьшую концентрацию антибиотика, подавляющую видимый рост бактерий. Использовали следующие контрольные штаммы микроорганизмов: Pseudomonas aeruginosa ATCC № 27853, Staphylococcus aureus ATCC № 25923, Escherichia coli ATCC № 25922, полученных из ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ Statistica 6,0 (StatSoft, USA). Данные представляли в виде медианы (Me), границ нижнего и верхнего квартиля (Lq-Hq), достоверность различий рассчитывалась по U-критерию Манна - Уитни и принималась при значениях p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Структурные характеристики получаемых композиций.
Использованный нами материал коллоидного аморфного диоксида кремния, согласно электронно-микроскопическим исследованиям, состоял из округлых наночастиц размером 20-100 нм, агрегированных в рыхлые агрегаты размером 5-100 мкм. В водной среде агрегаты частично разрушались, образуя суспензию с частицами нано-SiO2 размером 5-20 мкм. При механохимическом получении композиций с антибиотиками происходило дальнейшее уменьшение размеров агрегатов, то есть в механохимически полученных композициях удавалось существенно (приблизительно в 50 раз, до 36 вес. %) увеличить массовую долю мелких (менее 3-5 мкм), потенциально наиболее биологически активных фракций частиц - носителей.
Иммобилизация антибиотиков частицами диоксида кремния.
Мы провели оценку количества антибиотиков, сорбированных на наноструктурированных частицах коллоидного диоксида кремния. Экспериментально определенная степень сорбции исследованных антибиотиков, определяемая как отношение массы антибиотика к массе нано-SiO2 в полученных композициях, при массовом соотношении антибиотик/нано-SiO2 = 30/1, колеблется в пределах 35-45 вес. %. Учитывая неточность примененного метода (±15 %), степень сорбции была условно одинакова для всех антибиотиков. Такая относительно неизменная степень сорбции и легкость высвобождения сорбированного антибиотика, по нашему мнению, указывает на объемный механизм сорбции за счет эффекта мезопористости использованного материала нано-SiO2, то есть концентрационном накоплении антибиотика в порах частиц коллоидного диоксида
кремния.
Следовательно, независимо от возможного механизма сорбции, механохимическая обработка композиций позволяет многократно увеличить массовую и, соответственно, количественную долю малоразмерных фракций частиц нано-SiO2 и, тем самым, увеличить количество молекул антибиотиков, сорбированных наиболее биологически активными микро- и наноразмерными частицами, проникающими в бактериальные клетки.
Изучение антибактериальной активности.
Результаты двух независимых экспериментов по исследованию антибактериальной активности официнальных и модифицированных форм цефалоспоринов при серийных разведениях в МПБ представлены в таблице.
Уровни минимальной ингибирующей концентрации официнальных и модифицированных форм цефалоспориновых антибиотиков в тесте серийных разведений
в мясо-пептонном бульоне (Ме (25; 75 %))
Штамм микроорганизмов |
Цефтазидим |
Цефотаксим |
Цефепим |
Цефтриаксон |
||||
О.ф.- (1), n = 4 |
М.ф. (2), n = 4 |
О.ф.- (1), n = 4 |
М.ф. (2), n = 4 |
О.ф.- (1), n = 4 |
М.ф. (2), n = 4 |
О.ф. - (1), n = 4 |
М.ф. (2), n = 4 |
|
Staphylococcus aureus |
32,0 (32,0-32,0) |
8,0 (8,0-8,0)* |
4,0 (4,0-4,0) |
0,5 (0,5-0,5)* |
4,0 (4,0-4,0) |
4,0 (4,0-4,0) |
4,0 (4,0-4,0) |
4,0 (4,0-4,0) |
Pseudomonas aeruginosa |
16,0 (16,0-16,0) |
4,0 (4,0-4,0)* |
4,0 (4,0-4,0) |
4,0 (4,0-4,0) |
16,0 (16,0-16,0) |
1,0 (1,0-1,0)* |
4,0 (4,0-4,0) |
0,5 (0,5-0,5)* |
Escherichia coli |
16,0 (16,0-16,0) |
4,0 (4,0-4,0)* |
4,0 (4,0-4,0) |
4,0 (4,0-4,0) |
16,0 (16,0-16,0) |
1,0 (1,0-1,0)* |
4,0 (4,0-4,0) |
0,5 (0,5-0,5)* |
Примечание: О.ф. - официнальная форма антибиотика, М.ф. - модифицированная форма антибиотика; * - достоверность различий между формами антибиотика (p < 0,05).
При исследовании динамики роста Staphylococcus aureus выявлено статистически значимое различие в концентрации, вызывающей задержку роста в тесте серийных разведений антибиотиков в МПБ для цефтазидима и цефотаксима. МИК модифицированных форм цефтазидима и цефотаксима была меньше, чем при использовании официнальных форм данных антибиотиков. При изучении МИК для Pseudomonas aeruginosa было обнаружено, что модифицированный цефтазидим, цефепим и цефтриаксон подавляли рост микроорганизма в статистически значимо более низких концентрациях, по сравнению с официнальными формами.
Изучение МИК модифицированных форм антибиотиков в отношении Escherichia coli показало, что концентрация цефтазидима, цефепима и цефтриаксона, по сравнению с их официнальными формами, была меньшей (p < 0,05).
Таким образом, модифицированный цефтазидим обладал более выраженной антимикробной активностью в отношении всех трех штаммов изученных микроорганизмов. Модифицированная форма цефепима и цефтриаксона характеризовалась большей антимикробной активностью, по сравнению с официнальной, в отношении Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli. Модифицированный цефотаксим был более активен в подавлении видимого роста Staphylococcus aureus.
Полученные нами результаты исследования антимикробной активности антибиотиков, модифицированных механическим измельчением с сорбцией на нано-SiO2, согласуются с представленными в литературе данными о большей эффективности гентамицина, конъюгированного с наночастицами биодеградируемой золь-гелиевой тетраэтилортосилики [9]. Сообщается также о повышении антибактериальной активности антибиотиков, конъюгированных с наночастицами серебра и золота [5, 8]. Так, наночастицы золота, покрытые цефалоспориновым антибиотиком II поколения - цефаклором, обладают более высокой антимикробной активностью по отношению к Staphylococcus aureus и Escherichia coli, по сравнению с нативным цефаклором, причем антимикробная активность обусловлена сочетанным действием входящих в этот комплекс исходных веществ. Антибиотик, ингибирует синтез пептидогликанов, а наночастицы золота формируют поры в клеточной стенке бактерий, что в конечном итоге приводит к гибели микроорганизмов [8]. На примере комплекса из хитозана с наночастицами золота и ампициллина было показано, что данная композиция обладает в 2 раза большей антимикробной активностью, по сравнению с официнальной формой данного антибиотика [6].
Заключение
В результате применения механохимической технологии получения композиций антибиотик/нано-SiO2 происходит многократное увеличение доли наиболее биологически активных частиц нано-SiO2, которые являются «носителями» антибиотика, что приводит к увеличению антибактериальной активности полученных композиций, на основании уменьшения минимальной ингибирующей концентрации роста микроорганизмов in vitro. Таким образом, модификация антибиотиков группы цефалоспоринов - цефтазидима, цефепима, цефотаксима, цефтриаксона, методом механохимической обработки их смесей с коллоидным диоксидом кремния является перспективным методом повышения их антибактериальной активности.
Список литературы
- Богомолова Н.С. Перспективы использования нового цефалоспоринового антибиотика четвертого поколения в хирургии / Н.С. Богомолова, Т.Д. Орешкина, Л.В. Большаков // Антибиотики и химиотерапия. - 2003. - Т. 48, № 7. - С. 7-11.
- Гайдуль К.В. Сравнительное исследование иммуноактивных и антибактериальных свойств нативного и механически модифицированного цефотаксима // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2009. - № 2/1. - С. 202-203.
- Душкин А.В. Возможности механохимической технологии органического синтеза и получения новых материалов // Химия в интересах устойчивого развития. - 2004. - Т.12, №3. - С. 251-274.
- Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания. - МУК 4.2.1890-04. - 91 с.
- Орлов Д.С. Действие комплексов природных антимикробных пептидов и наночастиц серебра на микроорганизмы // Цитокины и воспаление. - 2010. - Т.9, № 2. - С. 32-36.
- Chamundeeswari M. Preparation, characterization and evaluation of a biopolymeric gold nanocomposite with antimicrobial activity // Biotechnol. Appl. Biochem. - 2010. - Vol. 55. - P. 29-35.
- Dushkin A.V. Mechanochemical synthesis of organic compounds and rapidly soluble materials: in High-energy ball milling. - Mechanochemical processing of nanopowders. - Woodhead Publishing Limited. - Oxford, 2010. - P. 249-273.
- Rai A. Antibiotic mediated synthesis of gold nanoparticles with potent antimicrobial activity and their application in antimicrobial coatings. / A. Rai, A. Prabhune, C.C. Perry // J. Mater. Chem. - 2010. - Vol. 20. - P. 6789-6798.
- Seleem M. N. Silica-Antibiotic hybrid nanoparticles for targeting intracellular pathogens // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2009. - P. 4270-4274.
- Slowing I.I. Mesoporous silica nanoparticles as controlled release drug delivery and gene transfection carriers // Adv. Drug. Deliv. Rev. - 2008. - Vol. 60. - P. 1278-1288.
Рецензенты:
Смагин А.А., д.м.н., профессор, зав. лабораторией лимфодетоксикации НИИКЭЛ СО РАМН, г. Новосибирск;
Павлов В.В., д.м.н., ведущий научный сотрудник, зав. отделением эндопротезирования и эндоскопической хирургии суставов ФГУ «Новосибирский НИИТО» Росздравсоцразвития, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 20.05.2011.