Онкогенез - одна из неразрешенных проблем современной медицинской науки. Многие авторы [2, 3, 8] обращают внимание на значимость изучения процессов дифференцировки и механизмов контроля передачи митотического сигнала в опухолевой клетке. Наше внимание привлек гормон эмбрионального периода хорионический гонадотропин человека (ХГч), известный как стимулятор регенерации патологически изменённых органов.
Рецепторы к ХГч имеются на клетках молочной железы, гонад и эмбриональных тканей. Определение хорионического гонадотропина информативно при таких опухолях, как хорионкарцинома, семинома и различные варианты тератом. ХГч рассматривается как маркер злокачественного процесса, прогностически значимый для больных с указанной патологией [1]. Тем не менее действие данного гормона не ограничивается внутриутробным периодом и гонадотропным влиянием. Ранее нами [4] было показано, что он способен повышать митотическую активность нормальных гепатоцитов при циррозе и резекции печени в эксперименте с 0,04 до 4,26 ‰. В связи с этим возник вопрос о возможной онкогенности гормона. Впоследствии выяснилось, что данный гормон способен подавлять митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов, клеток промиелоидного лейкоза HL-60 in vitro и ряда лейкемий in vivo [8]. ХГч способен подавлять рак молочной железы MCF-7 через активацию апоптоза, увеличивать чувствительность клеток MCF-7 in vitro к действию лучевых агентов. На основании полученных данных было предложено использовать хорионический гонадотропин в адъювантной терапии рака молочной железы. [10] Доказано, что вышеперечисленные клетки имеют на своей поверхности рецепторы к ХГч, через которые он и осуществляет свое действие.
Известно, что именно гиперактивность того или иного ростового фактора способна запустить в клетке неконтролируемый пролиферативный ответ и иммортализовать её. В предыдущих исследованиях нами было определено действие ХГч в высоких концентрациях (50, 100 и 150 МЕ/мл) на клетки Нер-2 (карцинома гортани). Данные концентрации были использованы с целью гиперстимуляции клеток. Оказалось, что ХГч в таком диапазоне не стимулирует, а подавляет культуру карциномы гортани Нер-2 и способствует дезорганизации монослоя. [7] Эпителий гортани не является гормонзависимой тканью, как эпителий молочной железы, и не является производным гемопоэтического дифферона, как лейкемические клетки HL-60. В литературе нет данных о наличии на клетках Нер-2 рецепторов к гонадотропинам. В дальнейшем встал вопрос о действии гормона на данную клеточную линию в его физиологических концентрациях. По данным И.М. Солопаевой [8], ХГч присутствует в сыворотке здоровых небеременных женщин и мужчин. Её данные подтверждает А.А. Кишкун [1]. Таким образом, влияние ХГч на пролиферативную активность и морфофункциональное состояние клеток изучено недостаточно и исследование механизмов влияния ХГч на органы и ткани является актуальной медико-биологической задачей.
Материал и методы исследования
Для решения вышеуказанной задачи был исследован цитотоксический эффект ХГч с использованием теста с бромидом метилтиазолтетразолия (МТТ) для оценки специфической гибели клеток и тест на апоптоз. МТТ тест проводили в соответствии с рекомендациями МЗ РФ по оценке цитотоксичности новых фармакологических веществ [6]. В опытные триплеты вносили оффицинальный препарат хорионического гонадотропина (Московский эндокринный завод) и эмбихин в концентрациях 4 и 2 мкг/мл. Считывание оптической плотности лизата в лунках (ОП), которая прямо зависит от числа выживших клеток, проводили на ИФА-ридере (λ = 492 нм). В качестве препарата сравнения использовали цитостатик алкилирующего ряда эмбихин.
Для исследования апоптоза клеточный монослой в конце культивирования промывали фосфатно-солевым буфером, монослой диспергировали версеном. Далее вносили по 5 мкл смеси красителей бромистого этидия (EtBr) и акридинового оранжевого (AO) (25 мкг/мкл каждого). Подсчет числа апоптозных и некротических клеток осуществляли согласно протоколам Methods in Molecular Biology [9].
Результаты исследования и их обсуждение
Эмбихин в концентрации 4 мкг/мл вызывает снижение оптической плотности клеточного лизата в опытных лунках с 0,602 ± 0,048 у.е. (контроль) до 0,134 ± 0,012 у.е., что составило 77,7 %. (рис. 1, горизонтальная сплошная линия). Снижение концентрации эмбихина до 2 мкг/мл (рис. 1, горизонтальная пунктирная линия) вызывает снижение ОП до 0,469 ± 0,036 у.е., что составляет 22,04 % от исходных значений.
Рис. 1. Цитотоксическое действие ХГч и эмбихина на культуру Нер-2
При действии ХГч в концентрациях 1 и 2 МЕ/мл наблюдалось снижение ОП лизата в лунках в пределах от 20,38 до 22,95 %. Эти данные были близки к действию эмбихина в концентрации 2 мкг/мл. Следовательно, в данных концентрациях ХГч способен подавлять клетки карциномы гортани Нер-2. Однако увеличение концентрации ХГч до 4МЕ/мл не усиливает его цитотоксическое действие (р = 0,78). В комбинации ХГч с эмбихином результат оказался обратным. При действии эмбихина в дозе 4 мкг/мл все концентрации ХГч повышают выживаемость клеток, причем четко прослеживается зависимость «доза-эффект». При увеличении концентрации ХГч повышается и выживаемость клеток. При уменьшении концентрации цитостатика наполовину ХГч несколько усиливает его действие, но с возрастанием его дозы токсический эффект ослабевает. При исследовании процесса апоптоза клеточной линии Нер-2 данные МТТ-теста подтвердились (рис. 2).
Рис. 2. Содержание живых, апоптотических и некротических клеток
при действии ХГч и эмбихина
ХГч во всех исследованных концентрациях повышал число апоптозных клеток с 6,10 ± 1,36 до 17,73 ± 1,44 %. Повышение концентрации ХГч до 4 МЕ/мл вызывало снижение его проапоптотических свойств. Коэффициент корреляции концентрации гормона и количества апоптозных клеток между контрольной пробой и ХГч 2 МЕ/мл составил r = 0,99; при учете данных группы «ХГч 4 МЕ/мл» коэффициент корреляции снизился до r = 0,18. Аналогичная зависимость отмечается и в отношении доли некротических клеток.
Известно, что введение ХГч крысам с опухолевым графтом (лимфосаркома Плисса) вызывает фрагментацию хромосомной ДНК. При этом меньшие дозы хорионического гонадотропина раньше индуцируют апоптоз, что подтверждается морфологическими исследованиями, а его индукция не зависит от пути введения гормона. [8] Следовательно, хорионический гонадотропин может стимулировать апоптоз ряда опухолевых клеток различной тканевой и видовой принадлежности. Увеличение дозировки ХГч повышает его проапоптотические свойства только до определенного уровня, по достижении которого наблюдается обратный эффект.
Комбинирование гормона с цитостатиком во всех указанных дозах приводило к повышению выживаемости клеток, что также проявлялось дозозависимо (рис. 2). Коэффициент корреляции (показатель «живые клетки») для групп с содержанием эмбихина 4 мкг/мл в среде культивирования составил r = 0,998; аналогичный показатель для групп с содержанием эмбихина 2 мкг/мл в среде культивирования составил r = 0,895. Следовательно, сам по себе хорионический гонадотропин способен подавлять клетки карциномы Нер-2, повышая число апоптозных и некротических клеток, а добавление цитостатика препятствует данному процессу. Необходимо отметить некоторый диссонанс показателей апоптозного теста и МТТ-теста. В МТТ-тесте комбинация ХГч и 2 мкг/мл эмбихина несколько понижает оптическую плотность лизата в лунках (усиление токсичности), а аналогичные дозировки в апоптозном тесте показывают усиление противоапоптотической активности веществ. Вероятно, что помимо стимуляции апоптоза гормон замедляет метаболическую активность клеток Нер-2, что и отражается в МТТ-тесте. Как известно, механизм действия эмбихина заключается в алкилировании нуклеофильных центров молекулы ДНК, что может вызывать ковалентную необратимую сшивку двух её цепей. [5] Невозможность репарации таких повреждений заканчивается р53-зависимым апоптозом, который является энергоемким процессом. В условиях замедленного метаболизма у клетки нет возможности включить программу апоптоза, что, в конечном счете, снизит количество апоптозных клеток
в пробе.
Выводы
Хорионический гонадотропин в концентрациях 1 и 2 МЕ/мл подавляет карциному гортани Нер-2 и стимулирует процессы апоптоза клеток. Увеличение концентрации ХГч в 2 раза с 2 до 4 МЕ/мл снижает цитотоксический эффекта гормона. Комбинирование хорионического гонадотропина с эмбихином понижает чувствительность клеток к цитостатику, возможно за счет снижения метаболической активности опухолевых клеток.
Рецензенты:
Погорельский И.П., д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник 48 ЦНИИ Минобороны России, г. Киров;
Щербатюк Т.Г., д.б.н., профессор, зав. кафедрой биологии ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия», г. Нижний Новгород.
Работа поступила в редакцию 06.07.2011.