Протеогликаны (ПГ) - сложные макромолекулы, состоящие из цепей гликозаминогликанов (ГАГ), ковалентно связанных с белковым кором. Они являются обязательным компонентом всех животных клеток и участвуют в таких фундаментальных биологических процессах, как дифференцировка, морфогенез, пролиферация [2; 3].
В частности, имеются данные об активной роли протеогликанов в регуляции сперматогенеза [7, 9, 10].
Протеогликаны представляют собой очень гетерогенный класс макромолекул, которые отличаются друг от друга по молекулярному весу, составу, тонкой структуре ГАГ цепей и функциям. Особенностью этого класса биологических молекул является их строгая органная специфичность и отсутствие видовой специфичности [8]. Это, в частности, делает протеогликаны прекрасным объектом исследования в токсикологических экспериментах, когда выявленные на животных изменения могут смело экстраполироваться на человека. Актуальность этой задачи диктуется увеличением числа случаев идиопатического бесплодия у мужчин репродуктивного возраста.
Целью нашего исследования стало получение антител к протеогликанам эпидидимисов и семенников крыс и последующий иммунохимический анализ распространения и динамики уровня этого вида протеогликанов.
В экспериментальной части работы использовались беспородные белые крысы. Все животные соответствовали показателям биологической нормы. Возраст крыс составлял 6-7 месяцев (половозрелые особи). Масса тела крыс была 180-240 г.
Забор семенников и эпидидимисов у крыс проводили под эфирным наркозом (экспериментальные исследования проводились в строгом соответствии с Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным). Контрольная группа состояла из 156 самцов.
Для выделения протеогликанов использовали методику В.И. Рыковой с соавт. [4]. Из гомогенизированной ткани получали фенольный экстракт, водную фазу его подкисляли, отделяли осадок, промывали его спиртом и сушили. Контроль проводили методом электрофореза на ацетат-целлюлозных пластинах рН - 5,0. Окраска осуществлялась 0,1 % альциановым голубым в 1 % СН3СООН. На следующей стадии выделенные протеогликаны подавергали ферментации для удаления углеводного компонента и раскрытия специфических белковых детерминант. С этой целью препарат протеогликанов смешивали с иммобилизованными препаратами хондроитиназы АС(Sigma) и гепариназы III (Sigma) из расчета 0,01 ед. каждого фермента на 20 мкг протеогликана в пробе [1].Ферментативное расщепление проводили в течение 5 часов при 37 ºС в соответствии с инструкциями фирмы производителя. Далее фракции протеогликанов центрифугировали, диализовали и лиофилизировали.
Полученный препарат ПГ использовали для иммунизации кроликов и кур. Выбор разных животных обусловлен общеизвестным фактом отсутствия видовой специфичности у протеогликанов, но особенностью семенников является их «иммунопривелегированность» [6].
Для иммунизации животных нами применены несколько схем иммунизации
1. Иммунизацию кроликов проводили путем 8 внутримышечных инъекций в возрастающих дозах препарата ПГ с интервалом в 2-3 дня. При этом антиген вводили раздельно в разные участки тела животного. Через 7-10 дней брали кровь, получали сыворотку и определяли ее активность в реакции преципитации. Ввиду разной реактивности продуцентов целесообразно проводить гипериммунизацию по циклам: 1-й цикл - 8 инъекций, 2-й цикл - 2 инъекции. Животных, давших активную сыворотку после 1-го цикла, переводят в эксплуатационную группу, остальных подвергают второму циклу гипериммунизации, что экономически оправдано.
2. 2-йспособ включает двух- или трехкратную иммунизацию кроликов антигеном с адъювантом Фрейнда для достижения в крови животных необходимого уровня антител к ПГ с титром по реакции преципитации не менее 1:2.
3. При иммунизации кур иммуноген вводили подкожно трехкратно с двухнедельными интервалами. Однократная доза иммунизации составляла 1000 мкг (по белку) на животное. Через десять дней после последней иммунизации проводили определение титров антител к ПГ.
4. При иммунизации кур животным вводили внутримышечно трехкратно с интервалом через две недели по 450 мкг (по белку) препарата протеогликана.
Анализ полученных сывороток показал, что для получения антител к протеогликанам семенников и эпидидимисов крыс оптимально подходят в качестве продуцентов антител куры. При меньших затратах антигена и в сравнимые сроки удалось получить преципитирующие сыворотки со значительно большим титром антител. Далее в работе применялась лишь сливная куриная антисыворотка к протеогликанам семенников и эпидидимисов крыс.
Иммуноэлектрофоретический анализ (рис. 1) показал, что в водносолевых экстрактах семенников и эпидидимисов крыс с антисывороткой к сыворотке крови крыс выявляется широкий спектр антигенов, но антисыворотка, полученная к препарату протеогликанов на уровне чувствительности иммуноэлектрофореза не обнаруживает антигенной активности. В препарате протеогликанов семенников и эпидидимисов крыс эта антисыворотка выявляет два антигена с электрофоретической подвижностью альфа-1 и альфа-2 глобулинов. Полуколичественный анализ обнаруженных антигенов (титрование с антисывороткой) показал, что содержание протеогликана альфа-2 (ПГА-2) более чем в 128 раз превышает содержание протеогликана альфа-1(ПГА-1). Предварительный расчет показывает, что концентрация ПГА-2 с учетом общепринятой чувствительности иммунодиффузионных тест систем 5 мкг/мл и концентрации белка в препарате протеогликанов после ферментации - 7,5 мг/мл составляет 1,3 мг/мл или 17 % от общего белка препарата.
Рис. 1. Иммуноэлектрофорез протеогликанов семенников и эпидидимисов крыс:
1 - водносолевой экстракт семенников и эпидидимисов крыс; 2 - фракция протеогликанов семенников и эпидидимисов крыс; 3 - очищенный препарат ПГА-2
Достаточно высокая концентрация антигена ПГА-2 позволила нам провести очистку этого белка на основе сочетания различных методов хроматографии.
Очистку ПГА-2 мы проводили по разработанному нами способу. Лиофилизированный после ферментации препарат протеогликанов семенников и эпидидимисов крыс растворяли в ТРИС-НCl буфере (рН = 7,8). Полученный раствор смешивали с равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония и центрифугировали в рефрижераторной центрифуге в течение 45-50 мин. при 10000 об./мин. Полученный осадок растворяли в минимальном объеме буфера и наносили на колонку сефадекс G-200. (Колонка 1,2×95 см, фракции по 1,5 мл).
Иммунохимический анализ хроматографических фракций показал что ПГА-2 выходит в свободном объеме колонки и расчет молекулярной массы белков содержащихся в 1 пике показал молекулярную массу 245-260 KD.
Следующая стадия очистки ПГА-2 основана на обнаруженной нами способности гепарина преципитировать ПГА-2. Заключительная стадия очистки ПГА-2 представляет собой аффинную хроматографию ПГА-2 на иммобилизованном гепарине. ПГА-2 обогащенные фракции объединяли и диализовали на «Amicon» РМ 10. Через колонку (1×18 см) гепарин-сефарозы, уравновешенную трис-Нс1 буфером, пропускали весь объем, полученных на предшествующей стадии фракций, содержащих ПГА-2. После нанесения препарата, колонку отмывали буфером (pH 7,5), содержащим 300 мМ NaCl. Элюцию аффинно-связанной фракции осуществляли с помощью ступенчатого градиента (ступень по 0,3 моль/л) хлористого натрия до концентрации 1,8 моль/л. Фракция, содержащая ПГА-2, отбиралась и концентрировалась.
Рис. 2. Электрофорез в полиакриламидном геле:
1 - очищенный препарат ПГА-2; 2 - фракция протеогликанов семенников и эпидидимисов крыс;
3 - водно-солевой экстракт протеогликанов семенников и эпидидимисов крыс
Иммунохимическая «чистота» препарата подтверждалась с помощью метода иммуноэлектрофореза (см. рис. 1), а также электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Препарат формировал одну линию преципитации в альфа-2-зоне глобулинов. При электрофорезе в ПААГе после окраски выявилась единственная полоса в альфа-2-зоне глобулинов.
Таким образом, иммунохимическими методами во фракции протеогликанов семенников и эпидидимисов крыс после ферментативного удаления большей части углеводной части обнаружено два антигенных компонента, представляющих собой, так называемые, коровые белки протеогликанов. Один из них удалось очистить и частично охарактеризовать. Это белок с молекулярной массой 245-260 KD и электрофоретической подвижностью альфа-2-глобулинов.
Учитывая данные об активной роли протеогликанов в регуляции сперматогенеза [9, 10] и многостадийный в том числе и пострибосомальный процесс [5] сборки этих сложных биомолекул, можно предположить, что протеогликаны могут явиться одним из наиболее уязвимых звеньев сперматогенеза и быть подвержены как эндогенным, так и экзогенным неблагоприятным факторам, вызывающим в конечном итоге, субфертильность и инфертильность. На этом основании нам представляется весьма перспективным разработка высокочувствительных и специфических иммунохимических тестов для мониторинга уровня протеогликанов, например, в семенной плазме.
Рецензенты:
Никулина Д.М., д.м.н., профессор, зав. кафедрой биологической химии с курсом лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия», г. Астрахань;
Молдавская А.А., д.м.н., профессор кафедры анатомии человека ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия», г. Астрахань.
Работа поступила в редакцию 09.09.2011.