В комплексе первоочередных задач по оздоровлению природной среды (водных и земельных ресурсов) от загрязнения ксенобиотиками, в том числе нефтью и нефтепродуктами, особое место принадлежит методам, основанным на управляемом применении отселектированных штаммов нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов (НиУОМ).
Установлено, что все или почти все углеводороды низкомолекулярной фракции нефти в сравнительно короткие сроки активно подвергаются метаболическому расщеплению: одни за счет испарения, растворения, а другие за счет ферментативной активности углеводородокисляющих микроорганизмов. Намного более сложные и длительные превращения в загрязненной среде претерпевают компоненты высокомолекулярной фракции нефти. Эти вещества не могут быть метаболизированы отдельными микроорганизмами, и их деструкция в природных условиях связывается с действием смешанных популяций микроорганизмов, т.е. сообществ, для которых характерны отношения кооперации, комменсализма и взаимопомощи.
Как показали наши исследования по утилизации нефти и нефтепродуктов с использованием аборигенных штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов, наибольшая степень деструкции нефти и нефтепродуктов достигалась в том случае, если в состав биопрепарата входили несколько штаммов-деструкторов [2, 5].
Выяснено, что в сложных сообществах микроорганизмы способны осуществлять совместную «метаболическую атаку» на субстрат. Отдельные члены такого сообщества, в отличие от сообщества в целом, не обладают метаболической активностью, необходимой для полного разрушения данного соединения. В результате совместной метаболической активности синтезируется достаточно эффективный для деструкции сложного полимера ферментативный комплекс.
Для создания высокоактивных искусственных ассоциаций культур бактерий необходимо учитывать взаимоотношения между микроорганизмами. При этом необязательно, чтобы ассоциация состояла только из активных нефтедеструкторов. Возможно, наиболее активной будет ассоциация, состоящая из нескольких активных нефтедеструкторов (ориентированных на разные фракции) и нескольких гетеротрофных микроорганизмов, не обладающих углеводородокисляющей способностью, но способных ассимилировать продукты промежуточного окисления углеводородов, часто токсичных для углеводородокисляющих организмов [1].
Создание управляемых ассоциаций НиУОМ, иммобилизованных на органических субстратах, одно из необходимых направлений исследований, направленных на разработку биотехнологических приемов и способов повышения эффективности процессов деструкции нефти и ее производных в природных водоемах, в очистке и доочистке технологических нефтесодержащих сточных вод, а также загрязненных нефтью земель сельскохозяйственного или иного пользования.
В развитие темы целью настоящей работы явилось изучение активности искусственно созданных ассоциаций (консорциумов) аэробных и анаэробных углеводородокисляющих микроорганизмов, иммобилизованных на органических субстратах растительного происхождения, приводящие к наиболее полной деструкции нефтяных загрязнений.
В качестве сорбентов для иммобилизации НиУОМ, наиболее перспективным является естественное органическое сырье растительного происхождения [4, 5]. К последнему относятся сорбенты, созданные на основе шелухи злаковых культур: гречихи, ячменя, пшеницы и др. В представленной статье рассматриваются сорбенты-носители на основе шелухи гречихи и шелухи ячменя.
Материал и методы исследования
Объектами исследований служили аборигенные штаммы нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенные из разнообразных природных объектов, относящихся к родам: Rhodococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Arthrobacter, Mycobacterium и Bacillus.
Для иммобилизации клеток в качестве сорбентов - носителей использовали гранулы с гречишной шелухой (ГШ) и ячменной шелухой (ЯШ) при заданном размере 0,1 мм и концентрации 2-5 мг/л.
В качестве единственного источника углерода применяли товарную нефть Альметьевского месторождения Республики Татарстан в концентрации 0,5 % (по объему).
Количественное определение остаточной нефти, для оценки нефтедеструктивной активности микроорганизмов, определяли гравиметрическим (весовым) методом, после ее экстракции четыреххлористым углеродом.
Деструкцию нефти, иммобилизованными и свободными суспендированными (для сравнения) клетками культур, осуществляли путем аэробного культивирования с использованием питательной среды Раймонда.
Иммобилизацию клеток бактерий проводили с использованием гранул агар-агара с добавлением ГШ и ЯШ. Получившиеся гранулы переносили в цилиндр на 50 мл с бактериальной суспензией. Для проведения адсорбционной иммобилизации [3, 6] клетки односуточной культуры центрифугировали 3-4 тыс. об./мин в течение 10-15 мин при 20-22 °С. Далее отмывали в физиологическом растворе (рН = 7,2) и готовили суспензию, содержащую 108-109 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл. Полученной бактериальной суспензией объемом 1 мл смачивали 1 см3 носитель. Процесс сорбции проводили в статических условиях при температуре 28 оС в течение 2 ч, далее при температуре 4 оС в течение 3 ч.
В качестве контроля использовали колбы со средой и нефтепродуктами без микроорганизмов.
В экспериментах с ассоциациями колбы засевали тремя и десятью культурами. Опыты проводили в трех повторностях.
Результаты исследования и их обсуждение
Опытами установлено, что эффективность процесса биодеградации пленочной нефти выше в опытах с применением клеток микроорганизмов, иммобилизованных на гранулах с ГШ и ЯШ по сравнению с суспендированными клетками. При этом пленка превращалась во множество мелких частиц размером от 0,1 до 0,4 мм в диметре, которые впоследствии оседали на дно.
Из наблюдений следует, что в процессе культивирования смешанных форм микроорганизмов в суспендированном и иммобилизованном состояниях, на минеральной среде с внесением товарной нефти, происходило постепенное возрастание плотности бактериальной массы. Это отражалась в увеличении численности нефтеокисляющих бактерий в среде, что не констатировано в контроле. Балансовые расчеты по окисленной нефти по этим опытам также выявили, что наиболее высокая деструкция наблюдается с применением в качестве сорбентов ГШ и ЯШ. С тремя культурами (предварительный опыт) НиУОМ, адсорбированными на гранулах с ГШ, нефтедеструкция составляла 66 %, с применением ЯШ доходило до 56,17 %, а со свободными культурами не превышала 27,3 %. Очевидно, это определяется созданием сорбентами активной поверхности соприкосновения с искомым загрязнением и углеводородокисляющими микроорганизмами.
В последующих опытах эксперименты проводили с консорциумом десяти видов нефтеокисляющих бактерий. ГШ и ЯШ использовали в той же пропорции и концентрации, что и предыдущем опыте. Иммобилизацию НиУОМ осуществляли согласно описанной выше методике.
Как видно из рисунке в вариантах с 10 культурами, иммобилизованными на гранулах ГШ, окисление нефти составляла 85 %, с использованием ЯШ не превышала - 67,17 %, а со свободными культурами - 35,7 %.
Деструкция нефти ассоциациями культур микроорганизмов в суспендированном и иммобилизованном состояниях
Анализ развития нефтеокислящих бактерий в опытах с сорбентом ГШ, выявил, что последние обладают более высокой скоростью роста на нефти и высокой степенью иммобилизации клеток на данном органическом носителе. Стабильное увеличение численности, в конечном итоге, отражается на скорости и полноте биодеградации нефти. Действительно, при применении ГШ всегда наблюдается высокая степень усвоения нефти микроорганизмами.
По всей вероятности ГШ выступает наилучшим активным биостимулятором жизнедеятельности углеводородокисляющих микроорганизмов, чем шелуха ячменя (в ее состав входит наименьшее количество углеводов, липидов).
Известно [7], что шелуха гречихи содержит в себе множество питательных веществ - 23 элемента в разных концентрациях с преобладанием калия, магния, фосфора, бора, кремния и кальция. В составе имеются фосфолипиды и двенадцать кислот, среди которых превалируют пальмитиновая (16:0) стеариновая (18:0), олеиновая (18:1) и линолевая (18:2), широко используемые многими группами гетеротрофных бактерий. Очевидно, что органические субстраты растительного происхождения - в виде шелухи, остатков зерновых культур, могут быть широко применены как сорбенты для иммобилизации НиУОМ и выполнять роль легкоокисляемых органических веществ, действием которых достигается ускоренное очищение загрязненных нефтепродуктами вод разнообразной природы.
Исследования по применению гречишной и ячменной шелухи в качестве сорбента для иммобилизации углеводородокисляющих микроорганизмов продолжаются с целью разработки биометодов управляемой очистки поверхностных вод, а также технологических стоков от ксенобиотиков.
Рецензенты:
Садыков Н.С., д.б.н., профессор, зав. лабораторией ФГБУ Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности «ФЦТРБ-ВНИВИ» Министерства сельского хозяйства РФ,
г. Казань;
Азимов Ю.И., д.т.н., профессор кафедры статистики и естествознания Казанского федерального университета, г. Казань.
Работа поступила в редакцию 10.10.2011.