Флуоресценция некоторых синтетических красителей широко используется в качестве оптических зондов для изучения механизма самых различных клеточных процессов. Ранее проведенные нами исследования показали возможность индуцирования в клетках дрожжей Candida guilliermondii ВКМ-У-916, не содержащих хлорофилла, при помощи введения в них красителя акридинового оранжевого (АО).
Выявлено, что мсек-ЗЭС возникает только при проникновении АО в клетку в результате взаимодействия с клеточными и мембранными компонентами, вероятно, белками, липопротеинами и нуклеиновыми кислотами [1-10]. Сделан вывод о том, что мсек-ЗЭС АО может быть использована для изучения влияния биогенных и абиогенных факторов среды на биологические системы [6].
Можно предположить, что исследование этого явления позволит выявить новые экспериментальные пути для изучения внутриклеточных процессов.
Согласно определению флуоресцентными зондами являются молекулы, которые обратимо (нековалентно) связываются с биоструктурами и из параметров флуоресценции можно извлечь определенную информацию о структурно-функциональном состоянии биообъекта [3-5]. Полихроматические флуоресцентные зонды-ионы могут быть информативны для изучения изменений в живых клетах при действии ксенобиотиков [12].
Эффект воздействия заряженного ксенобиотика на живую клетку зависит не только от его исходной химической структуры, но и от исходного физиологического состояния самой клетки [12].
В начале 1960 годов некоторыми авторами изучено влияние ДНФ на микроорганизмы. Показано, что при концентрации 6∙10-5 М ДНФ разобщает окислительное фосфолирование на 80 % в клетках
E.coli.
В клетках других микроорганизмов ДНФ при концентрации 6∙10-4 М угнетал окисление на 50 %. При рН 7∙10-3 М ДНФ разобщает окислительное фосфолирование в препарате A. vineladi на 30 %, а при рН 6 на 98 %. Кроме того, показано, что клетки M.phlei очень чувствительны к действию разобщителей и концентрация ДНФ 8∙10-5 М разобщает окислительное фосфолирование на 79 % [7].
Известно, что, внедряясь в мембрану, клетки ионы ксенобиотиков могут изменить ее характеристики: поверхностный заряд, проницаемость, трансмембранный потенциал. Эти изменения должны отразиться на сродстве заряженных зондов к мембране и на скорости их диффузии в клетку [5]. Классическим разобщителем окислительного фосфолирования и дыхания является ДНФ [13]. В работах Скулачева В.Н. показано, что степень разобщающего эффекта ДНФ (ксенобиотика анионного типа) в изолированных митохондриях зависит от соотношения в среде его ионизированной и неионизированной форм [14]. Как известно, снижение потенциала на мембранах митохондрий разобщителем окислительного фосфолирования ДНФ при концентрациях в среде не выше 0,1 мМ обусловлено увеличением протонной проницаемости митохондриальных мембран [14].
Морозовой Г.И. показано, что добавление в среду 1 Мм ДНФ вызывает полное тушение флуоресценции ДСМ в митохондриях лимфоцитов. Эффект 1 Мм ДНФ, вероятно, связан с неспецифическим повреждением клеточных мембран [12].
Разобщающее действие ДНФ показано также на Saccharomyces cerevisiе. Наблюдался выход из клеток К+ , уменьшение мембранного потенциала и снижение уровня АТФ (до 80 %) [17].
Мусаевым Н.А. изучены возможные механизмы модификации транспортных свойств плазматической мембраны клеток Nitellopsis разобщителями окислительного фосфолирования. Наиболее эффективные концентрации 2-4-динитрофенола находились в диапазоне 10-5...5∙10-4 М [11].
Падалко В.И. с соавторами было показано, что «мягкое» применение определенных концентраций протонофора может увеличивать продолжительность жизни мышей, дрожжей и мух [15, 18].
В настоящей работе исследовано влияние 2,4-динитрофенола (ДНФ)-ксенобиотика анионного типа на интенсивность мсек-ЗЭС АО в клетках дрожжей.
Материалы и методы исследования
Обьектом исследования служили клетки дрожжей Candida gulliermondii BKMY-916. Культуру дрожжей выращивали на сусло-агаре (4 Балл). Опыты проводили со свежеприготовленной суспензией 3-х суточной культуры.
В работе использована фотометрическая установка, позволяющая регистрировать мсек-ЗЭС. В установке был применен фосфороскоп. Интервал между моментами освещения и регистрации свечения образца, расположенного во внутреннем цилиндре фосфороскопа, составлял 3,3 млс. Обьект освещали галогеновой лампой накаливания 300 Вт, с воздушным охлаждением.
В работе использовали АО, производства фирмы «Siqma».
Опыты проводили следующим образом: в суспензию клеток с плотностью 1∙108М кл/мл вводился водный раствор красителя в концентрации 10-5 М. Затем образцы суспензии в объеме 5 мл помещались в термостатируемую измерительную кювету фотометрической установки и производились измерения свечения.
Конечные концентрации 2,4-динитрофенола в суспензии клеток дрожжей готовили в концентрации 10-7...10-3 М.
Инкубацию живых клеток с ксенобиотиками производили в течение 30 минут при температуре 20 °С. После обработки ДНФ клетки осаждали центрифугированием и готовили суспензию в фосфатном буфере.
Результаты исследования и их обсуждение
При освещении суспензии клеток дрожжей, предварительно обработанных красителем АО, возникает мсек ЗЭС. На рис. 1. представлена кривая, характеризующая мсек-ЗЭС АО в клетках дрожжей. Мсек-ЗЭС АО зависит от концентрации АО, температуры и рН среды, имея максимальный выход при концентрации АО 10-5 М, в физиологической зоне температур 20-25 °С и рН-7. Кроме того, полученная кривая имеет насыщение при плотности клеток 108 клеток на мл.
Установлено, что мсек-ЗЭС АО в клетке связано лишь с интактным состоянием клеток. Так, например при кратковременном кипячении суспензии клеток полностью снимает возбуждение мсек-ЗЭС.
По мнению ряда авторов, флуоресцентные зонды типа ДАС ПМИ, АНС, АО и др. имеют довольно простую структуру молекулы и связываются с мембранами главным образом благодаря гидрофобному взаимодействию, модулированному более слабым электростатическим взаимодействием [3-4].
Поэтому очевидно, что такие зонды не могут обладать высокой специфичностью: они связываются с разными мембранами, иногда с белками цитоплазмы и с хроматином ядра [4, 5, 8].
На основании ранее полученных нами и литературных данных показано, что мсек-ЗЭС возникает в результате взаимодействия с клеточными и мембранными компонентами, вероятно, белками, липопротеинами и нуклеиновыми кислотами [1, 2, 6, 10,16].
Изучалось влияние ДНФ на клетки дрожжей на основании исследования изменения мсек ЗЭС флуоресцентного зонда акридинового оранжевого, введенного в клетки. На рис. 2. Показана зависимость интенсивности мсек-ЗЭС АО от концентрации ДНФ.
Как видно из рис. 2, при концентрации ДНФ 10-7 М интенсивность мсек-ЗЭС АО существенно не изменяется по сравнению с контролем. По мере увеличения концентрации ксенобиотика (5∙10-6...10-5 М) интенсивность мсек-ЗЭС АО уменьшается. Добавление в суспензию клеток ДНФ в концентрации 10-4 М вызывает полное тушение свечения АО.
Рис. 1. Кинетика мсек-ЗЭС АО в клетках дрожжей. Плотность клеток в суспензии 108 кл
на мл, концентрация АО 10-5 М, температура 25 °С. Стрелками указаны моменты включения и выключения возбуждающего света. Т1 - начало появления мсек ЗЭС; Т2 - время достижения стационарного уровня; S - высота стационарного уровня
Рис. 2. Зависимость интенсивности мсек-ЗЭС АО в клетке от концентрации ДНФ.
Остальные условия те же, что на рис. 1. Инкубация клеток с ДНФ 30 минут
Как было показано ранее, оптимальной для выхода мсекЗЭС АО является нейтральная среда (рН‒7,0). При кислых и щелочных средах интенсивность свечения падает [6].
В настоящей работе нами также изучено влияние ДНФ на интенсивность мсекЗЭС АО в зависимости от рН среды (рис. 3).
Известно, что ДНФ является слабой кислотой. Для слабых кислот характерно относительно высокая степень диссоциации в нейтральных или близких к ним средах. При низком рН диссоциация снижается. Тем самым при рН 7-6 для ионов ДНФ, имеющих электрический заряд, значительно больше, чем при рН 4-3. Вместе с тем проницаемость клеточной оболочки для ионов значительно ниже, чем для нейтральных молекул. Следовательно, вероятность входа молекул ДНФ в клетку выше при низких значениях рН, чем при нейтральных [9].
Как видно из рис. 3, в клетках инкубированных ДНФ при рН 4‒6 интенсивность мсекЗЭС АО значительно ниже, чем в контрольных клетках, не обработанных ДНФ, но находящихся в течение 30 минут при рН 4‒6. В клетках дрожжей инкубированных ДНФ при рН 8-9 интенсивность мсекЗЭС АО выше, чем при рН4 и рН5. Очевидно значительное снижение интенсивности мсекЗЭС АО в клетках дрожжей при низком рН обусловлено в основном ДНФ.
Рис. 3. Зависимость интенсивности мсек-ЗЭ САО в клетке
от рн, остальные условия те же, что на рис. 1:
1 - контроль; 2 - клетки, инкубированные ДНФ концентрацией 10-5 М в течение 30 минут
Из представленных данных следует, что при предварительном инкубировании клеток с ДНФ, концентрации которых приводят к снижению интенсивности мсек-ЗЭС АО, соответствуют концентрациям ДНФ как разобщителя окислительного фосфолирования клетки.
На основании полученных данных, можно заключить, что возбуждение мсек-ЗЭС АО в клетках дрожжей наблюдается в живых клетках и этот процесс очень чувствителен к фактором, действующим на интактное состояние клеток. Регистрация мсек-ЗЭС АО в клетках может служить биофизическим методом для оценки реакции клеток на внешние воздействия, свойств, а также для определения различных соединений как разобщителей окислительного фосфолирования.
Рецензенты:
Курбанова И.М., д.б.н., главный научный сотрудник лаборатории биофизики Института ботаники НАН Азербайджана, г. Баку;
Джафаров Э.С., д.б.н., руководитель лаборатории «Радиобиологии» Института радиационных проблем НАН Азербайджана, г. Баку.
Работа поступила в редакцию 18.10.2011.