В настоящее время наряду с традиционными методами изучения растений в селекционных, генетических и таксономических исследованиях всё большее значение приобретают методы, основанные на выяснении изменчивости ДНК и ее структуры. Данные методы позволяют с высокой точностью определить характер изменчивости генетического материала, что даёт возможность уже на ранних стадиях развития растения выявить особи с наиболее ярко выраженными полезными качествами [4]. Однако для проведения молекулярно-генетических исследований, связанных с изучением структуры генов, на первом этапе необходимо получить чистый препарат ДНК без признаков деградации и примесей.

Было экспериментально установлено, что лучшие результаты получаются при выделении ДНК из почек и молодых листьев растения [5], в то время как во всех мертвых клетках (например, в ксилеме покрытосемянных) наблюдается деградация ДНК, что делает невозможным проведение дальнейшего анализа. Особое внимание необходимо уделять и видовой принадлежности изу­чаемого образца, так как растения разных видов характеризуются различными физиологическими и биохимическими особенностями как, например, присутствием различных веществ (полисахаридов, танинов, полифенолов и их хинонокисленных продуктов), создающих значительные примеси в препаратах нуклеиновых. Физико-химические свойства подобных веществ в определенной степени совпадают со свойствами нуклеиновых кислот, что затрудняет их полное отделение от ДНК и обусловливает низкое качество препаратов, что делает непригодным их дальнейшее использование.

Объектом наших исследований стали растения рода рододендрон (Rho­do­den­dron L.). Это многочисленный род растений семейства Вересковые (Ericaceae), включающий около тысячи видов вечнозеленых, полулистопадных и листопадных кустарников и деревьев. Рододендроны лишь сравнительно недавно стали у нас по-настоящему популярны. Есть несколько причин этому: во-первых, некоторые из них - единственные вечнозеленые лиственные растения, зимующие в нашем климате. Во-вторых, цветение рододендронов - удивительное зрелище, с которым мало что может сравниться [7]. Известно также, что рододендроны содержат большое количество дубильных веществ, что необходимо принимать во внимание при проведении молекулярно-генетических исследований растений данного рода, требующих выделения ДНК.

Целью настоящей работы явилось исследование возможности применения стандартной методики выделения ДНК из растений на представителях рода Rhododendron и оптимизации данной методики для конкретного объекта.

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили листья растений рододендрона.

Процесс выделения ДНК включает несколько этапов.

Первый этап связан с разрушением клеточных структур. Для разрушения мембран используется механическое воздействие путем растирания ткани в специальных гомогенизаторах или вручную с помощью пестика. Однако следует отметить, что при выборе разрушающего агента и метода разрушения клеточных структур важно учитывать возможность повреждения молекул ДНК самими агентами или условиями выделения [1].

На следующем этапе выделения ДНК проводится ее очистка от разрушенных клеточных структур, высоко- и низкомолекулярных соединений. Удаление белков осуществляют путем их денатурации с помощью фенола, хлороформа, ацетона и некоторых солей.

Важным этапом при выделении ДНК является ее осаждение. Наиболее часто используемый метод концентрирования - осаждение ее изопропанолом или этанолом [5].

В ряде случаев требуется очистка препаратов от содержания РНК. Это достигается применением фермента РНК-азы [2].

Задачей данного исследования явилось изучение возможности применения стандартной методики выделения ДНК из растений [10] на представителях рода Rhododendron. Основным способом получения ДНК является метод, основанный на использовании ЦТАБ (цетилтриметиламмоний бромид)-буфера. Данная методика основана на том, что при высоких концентрациях солей нуклеиновые кислоты образуют стабильные и растворимые соединения с цетилтриэтиламмоний бромидом. При снижении концентрации соли NaCl ниже 0,4 М комплекс ЦТАБ - нуклеиновая кислота выпадает в осадок. После разрушения клеток белки денатурируют и экстрагируют смесью хлороформа с изоамиловым спиртом. ЦТАБ удаляют путем осаждения этанолом (ЦТАБ растворим в этаноле, а ДНК нет). В данной методике предполагается использование четырех буферных растворов (2x ЦTAБ буфер, 5x ЦTAБ буфер, буфер для преципитации и HS-TE буфер) следующего состава:

1. 2x ЦTAБ буфер (2% ЦTAБ, 1,4 M NaCl, 0,1 M Tris-НCl, pH 8.0, 20 мМ ЭДТА).
2. 5x ЦTAБ буфер (5% ЦTAБ, 350 мМ ЭДТА).
3. Буфер для преципитации (1% ЦTAБ, 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 10 мМ ЭДТА).
4. HS-TE буфер (1 M NaCl, 10 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА).

В общем виде схема выделения выглядит следующим образом:

1. ткань растереть в ступке с жидким азотом до светло-зелёной пудры;
2. подготовить прогретую до 65^оС пробирку с 2x ЦTAБ (из расчёта 25 мл 2x ЦTAБ на 2-5 г ткани);
3. перенести пудру шпателем в пробирку, очень хорошо и быстро перемешать;
4. инкубировать при 65°С минимум 20 мин (лучше 1 ч, но можно и больше (2-3 ч));
5. охладить до нормальной температуры (22-24°С), добавить равный объём смеси хлороформа и изоамилового спирта (в соотношении 24:1), перемешивать примерно 20 мин при нормальной температуре;
6. центрифугировать 11000g при нормальной температуре 30 с;
7. снять водную фазу, добавить к ней 0,2 объема 5x ЦTAБ;
8. перемешать, инкубировать при 65°С 10 минут;
9. добавить равный объём смеси хлороформа и изоамилового спирта (в соотношении 24:1), перемешивать примерно 10 мин при нормальной температуре;
10. центрифугировать 11000g при нормальной температуре 10 мин;
11. если раствор мутный или большая интер- фаза - повторить экстракцию хлороформом и изоамиловым спиртом (пункты 9-10);
12. добавить равный объём буфера для преципитации (можно и 2-3 объёма), перемешать и оставить на 1 ч (или на ночь) при нормальной температуре;
13. центрифугировать 5000-8000 g при нормальной температуре 20 мин (если ДНК не выпадает, добавить больше буфера для преципитации, оставить при комнатной температуре на 1 ч, отцентрифугировать);
14. растворить осадок в 1-2 мл HS-TE (иногда необходим нагрев до 65°С);
15. добавить 2 объема абсолютного этанола, инкубировать 1-2 ч при -20°С или 30 мин при -70°С;
16. центрифугировать 8000 g при 4°С, 10 мин;
17. к осадку добавить 200 мкл дистиллированной воды и 100 мкл 7,5 M ацетата аммония (pH 7,5), инкубировать 20 мин при 0°С;
18. центрифугировать 13000 g при 4°С 10 мин;
19. добавить к супернатанту 2 объема абсолютного этанола и инкубировать 20 мин при -70°С;
20. центрифугировать 13000 g при 4°С 10 мин;
21. сполоснуть 80%-м этанолом;
22. растворить в TE буфере или воде, хранить при -20°С.

Оценку эффективности выделения ДНК из листьев рододендрона проводили, используя электрофоретическое разделение полученных препаратов в агарозном геле, спектрофотометрическое определение концентрации и чистоты образцов, а также ПЦР [8].

Поскольку концентрация и чистота препарата ДНК являются важными факторами, влияющими на ход дальнейшего анализа, необходимо установление значений этих показателей с помощью спектрофотометра (в наших исследованиях был использован спектрофотометр СФ-102). Для определения количества ДНК измеряли поглощение раствора в областях с длинами волн 260 и 280 нм. Измерение при 260 нм позволяет рассчитать концентрацию нуклеиновой кислоты в пробе. Оптическая плотность D = 1 A соответствует приблизительно 50 мкг/мл двухцепочечной ДНК. Соотношение экстинкции 260 нм/280 нм позволяет судить о чистоте нуклеиновой кислоты. Чистые препараты ДНК имеют соотношение не менее 1,67 [3].

Наличие деградации в образцах может привести к неправильной спектрофотометрической оценке концентрации ДНК, к ее завышению вследствие явления гиперхромизма. Кроме того, данные препараты в дальнейшем малопригодны для работы по изучению и манипуляции с крупными фрагментами ДНК, поэтому для определения степени деградации молекул в полученных препаратах нами проводился электрофорез в 2%-м агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

Реакцию ПЦР проводили с использованием RAPD-праймера Oligo 29 в амплификаторе «Терцик» в течение 2 часов. Для ПЦР была использована реакционная смесь следующего состава: 2,5 мкл 10∙ПЦР буфера (100 мМ Трис-НCl; рН 8,8; 500 мМ КСl), 25 мМ MgCl2, смесь 10 мМ нуклеотидтрифосфатов, 10 мМ праймера, 1 ед. Taq ДНК-полимераза и 1 мкл ДНК (20 нг/мкл).

Параметром оценки эффективности ПЦР являлась воспроизводимость результатов с использованием данного способа экстракции ДНК, а также наличие или отсутствие фоновой амплификации, приводящей к появлению шмеров на электрофореграмме.

Использование стандартной методики для выделения ДНК ЦТАБ-методом из растений на рододендроне (весь процесс выделения занимает в среднем 7-8 часов) позволило нам получить препараты суммарной ДНК. Спектрофотометрическое исследование чистоты полученных образцов показало, что соотношение поглощения при 260 нм/280 нм было равно в среднем, 1.15. Это свидетельствует о том, что полученные образцы ДНК содержат примеси в больших количествах. Анализ электрофореграмм образцов ДНК рододендрона (рис. 1) позволяет говорить о деградации препарата.

Оценку эффективности ПЦР проводили с использованием RAPD-праймера Oligo 29 (рис. 2).

В результате проведения ПЦР с праймером Oligo 29, где в качестве матрицы использовалась ДНК, выделенная по стандартной методике, оказалось, что в большинстве случаев на электрофореграмме наблюдалось наличие шмера, в некоторых пробах вообще отсутствовали продукты амплификации, что свидетельствует о неполном удалении ингибиторов. Воспроизводимость результатов ПЦР равнялась 76%, что является весьма плохим результатом.

Обобщив полученные данные, можно заключить, что данный метод экстракции ДНК не является эффективным для растений рода Rhododendron.

Нами были изменены некоторые этапы стандартной методики и подобраны оптимальные температурные, временные и концентрационные условия, которые позволили получить препарат ДНК высокой концентрации с отсутствием деградации и примесей, что подтверждается спектрофотометрически и электрофореграммой в агарозном геле (рис. 3). Полученные образцы имели соотношение поглощения при 260 нм/280 нм равное, в среднем, 1,75, что свидетельствует о чистоте полученных препаратов ДНК.

Адаптированная для растений рода рододендрон методика отличается сравнительной быстротой (4 ч вместо 7-8 ч) и простотой (используется всего один буфер).

Для выделения суммарной клеточной ДНК использовали ЦТАБ-буфер следующего состава: 3% ЦТАБ, 1,4 М NaCl, 0,2% 2-меркаптоэтанол, 20 мМ ЭДТА, 100 мМ Tris-HCl (pH 8,0).

В общем виде усовершенствованная нами схема проведения выделения выглядит следующим образом:

1. образец ткани тщательно растирают пестиком в течение 5 минут в 1000 мкл, предварительно прогретого до 65°С ЦТАБ-буфера;
2. инкубируют в термостате при 65°С в течение 30 мин, периодически перемешивая раствор вращением пробирки (трясти пробирку не рекомендуется, т.к. буфер пенится, ДНК разрушается);
3. остудив пробирку до комнатной температуры, добавляют равный объём смеси хлороформ - изоамиловый спирт (24:1) и перемешивают медленным покачиванием в течение 20 мин;
4. разделяют фазы центрифугированием 15 мин (12000 g); супернатант переносят в чистую пробирку объемом 2 мл;
5. добавляют 2/3 объема изопропанола;
6. оставляют на 1 час при -20°С для осаждения ДНК;
7. центрифугируют 15 мин (13000 g), отбирают изопропанол;
8. добавляют два объема 80%-го этанола, инкубируют 15 мин, центрифугируют 15 мин (13000 g), тщательно удаляют спирт, подсушивают пробирку на воздухе для удаления паров спирта;
9. осадок ДНК растворяют в воде или ТЕ-буфере (0,01 М трис-HCl, pH 7,4, 0,1 мМ ЭДТА) до полного исчезновения осадка.

Проведенный ПЦР анализ с полученными по модифицированной методике образцами ДНК (рис. 4) позволяет говорить об отсутствии шмера и хорошей воспроизводимости результатов ПЦР, что, в свою очередь, свидетельствует о высоком качестве образцов ДНК и подтверждает эффективность усовершенствованной методики выделения.

Применение стандартной методики для выделения ДНК из растений представителей рода Rhododendron показало присутствие в полученных препаратах значительного количества примесей, а также деградацию ДНК, что было подтверждено результатами электрофореза и спектрофотометрически. Неполное удаление ингибиторов, полисахаридов и полифенолов приводит к угнетению последующих ферментативных реакций в процессе ПЦР и вызывает деградацию ДНК после длительного хранения. Для дальнейшего анализа данные препараты были непригодны.

С целью получения качественного препарата суммарной ДНК в стандартную методику выделения были внесены изменения и подобраны оптимальные временные, температурные и концентрационные условия, изменены некоторые этапы, что позволило в полной мере достичь поставленной цели.

Данная работа выполнена в рамках и при поддержке государственного контракта на выполнение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» № 16.518.11.7099 «Оценка состояния растительных ресурсов при интродукции в Центрально-Черноземном регионе и разработка мероприятий по их сохранению на базе ботанического сада им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета».

• Дурнова Н.А., д.б.н., доцент, зав. кафедрой общей биологии, фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, г. Саратов;
• Полуконова Н.В., д.б.н., профессор кафедры общей биологии, фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, г. Саратов.

Работа поступила в редакцию 06.04.2012.