Сведения о связи кобаламин-гемостаз ограничены, но позволяют утверждать:

1. Состояние гемостаза зависит от обеспеченности организма кобаламином (КБ), влияющим на тромбоцитопоэз, активность тромбоцитов и плазминовой системы, особенно на фоне атеросклеротических изменений в сердечно-сосудистой системе [2, 5, 17, 18].

2. Известны заболевания, протекающие с нарушениями гемостаза и дефицитом КБ [15, 19].

3. В эксперименте и клинике выявлено влияние КБ на некоторые про- и антикоагулянты, однако неясно, как влияет дефицит или дополнительное введение КБ на гемостаз в целом [13].

4. Данные о влиянии КБ на интегральные показатели гемостаза (непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину) единичны [14].

Следовательно, необходимо далее изучать связи между обеспеченностью организма КБ и гемостазом, обращая внимание на эффекты его дефицита и избытка при состояниях, протекающих с тромбофилией или кровоточивостью [14].

Цель работы - изучить влияние на НВСК, фибринолиз и толерантность к тромбину (ТкТР), на липидпероксидацию (ЛПО) и антиоксидантный потенциал (АОП) тромбоцитов при содержании животных на рационе с разными дозами КБ на фоне алиментарной гиперхолестеролемии разного уровня.

Опыты провели на нелинейных белых крысах (самцы, 180 ± 16 г), получавших сбалансированный пищевой рацион [4, 9, 10, 18]. Выбор крыс связан с тем, что большинство исследований по изучению гемостаза выполняли на этих животных [17]. В атерогенный рацион входил холестерол (ХЛ) по 0,2 г на особь в сут, чему предшествовало введение 6-метилтиоурацила (0,3 мг на особь в сут, 30 дней), который нарушает обмен липидов, снижая функциональную активность щитовидной железы, что ускоряет развитие гиперхолестеролемии и атеросклеротических сдвигов у крыс, устойчивых к избыточному поступлению с пищей ХЛ [4]. Контрольные группы получали рацион питания без 6-метилтиоурацила и холестерола.

 Пробы крови брали в шприц с 3,8%-м раствором цитрата натрия (9:1 по объему) из обнаженной яремной вены у наркотизированного диэтиловым эфиром животного, фиксированного на препаровочном станке. Рану закрывали 2-3 швами (кетгут). В плазме крови устанавливали уровень маркеров НВСК: продуктов деградации фибрина (ПДФ) [6], растворимых комплексов мономерного фибрина (РКМФ) [11], D-димеров («D-dimer test", Roche), фф. Р₃ и Р₄ в плазме по описанию [1]. Концентрацию в плазме осаждаемого тромбином фибриногена (ФГ) определяли спектрофотометрически [5], а Хагеман-зависимый фибринолиз по описанию [3]. Толерантность к тромбину (ТкТР) устанавливали согласно патенту [7]. Липидпероксидацию (ЛПО) в тромбоцитах и их антиоксидантный потенциал (АОП) оценивали, определяя уровень диеновых конъюгат (ДК) и продуктов, реагирующих с тиобарбитуратом (ТБК), период индукции (ПИ) и скорость окисления (СО) устанавливали по описанию [12] на флуориметре «Биан 130». Число n составляло 8-9 во всех группах и этапах.

Статистический анализ проводили с помощью медико-биологической программы Biostat 4.03 [8], используя вариационную статистику для малых рядов, вычисляя среднюю арифметическую, среднюю ошибку, среднеквадратическое отклонение, доверительный коэффициент Стъюдента и степень вероятности (р). Различия считали достоверными при значениях степени вероятности < 0,05.

Использованы: тромбин, фибриноген (ФГ) бычьей крови, тромбопластин, каолин и буфер Михаэлиса («Технология-стандарт»), набор «D-dimer test» («Roche»), изопропанол, хлорбензол, бутанол и кальция хлорид х.ч., цианокобаламин (ЗАО «Уфавит»), казеин и крахмал маисовый пищевой, масло подсолнечное рафинированное, смесь Осборна-Менделя (все реагенты х.ч.реагенты), ледяная уксусная кислота, концентрированная серная кислота, уксусный ангидрид, абсолютный этанол. Число n во всех группах крыс равно 8.

Вначале изучили эффекты возрастающих доз ХЛ на НВСК, фибринолиз и ТкТР на фоне рациона с кобаламином в соответствии с суточной потребностью (1 мкг/кг - полноценный рацион). Подопытные группы получали ХЛ по 0,2, 0,4 или 0,8 г/кг в сут, пробы брали в конце 6-й и 8-й недели. Из данных таблицы следует, что введение ХЛ (0,2 г/кг) заметно повышает уровень всех плазменных маркеров НВСК (наименьшая доза, использующаяся при оценке влияния ХЛ на атерогенез) к концу 6-й и особенно 8-й недели. Активность фибринолиза не меняется, а ТкТР падает к концу опыта. Увеличение дозы ХЛ в рационе сопровождается пропорциональным ускорением НВСК (выше доза - выше уровни всех маркеров), снижается уровень ФГ, что указывает на его ускоренное потребление, усиливающееся с дозой ХЛ.

Падает и ТкТР, а фибринолиз меняется мало. Уровень липидпероксидов с увеличением дозы ХЛ и длительности введения также повышается, а АОП, напротив, падает.

Изменения НВСК, фибринолиза, ТкТР, ЛПО и АОП при введении возрастающих доз холестерола (0,2, 0,4 или 0,8 г/кг в течение 6 или 8 недель)

Во 2-й группе опытов изучали влияние ХЛ на те же показатели, увеличивая дозу КБ в рационе и длительность опыта (6 и 8 недель крысы получали ХЛ в дозах 0,4; 0,6 или 0,8 г на особь в сут на фоне КБ в дозах, превышающих суточную потребность в 2, 8 или 16 раз).

И в этом случае подтвердилось свойство ХЛ ускорять НВСК - достоверно вырос уровень в плазме маркеров НВСК и выявилось, что введение КБ при всех испытанных дозах ХЛ ограничивает эффекты липида на НВСК и ТкТР, а фибринолиз активируется при 8- и 16-кратной дозе КБ. Скорость ЛПО под влиянием КБ уменьшалась, а АОП возрастал.

Заключая, выделим основные положения:

1. Высокие дозы ХЛ в полноценном рационе ускоряют НВСК до степени, которую можно рассматривать как начальную стадию ДВС крови.

2. Избыток КБ в дозах, адекватных малым лечебным, ограничивает эти сдвиги, а в дозах, адекватных высоким лечебным, усиливает их, и независимо от дозы ограничивает вызываемое введением холестерола снижение толерантности к тромбину.

3. Сдвигам скорости НВСК при гиперхолестеринемии сопутствуют ускорение ЛПО, снижение антиоксидантного потенциала тромбоцитов и активация фибринолиза.

Рецензенты:

Ральченко И.В., д.б.н., профессор кафедры фармацевтической технологии и фармакогнозии с курсом ботаники ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздравсоцразвития России, г. Тюмен№

Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, зав. кафедрой биохимии ГБОУ ВПО «Челябинская медицинская академия» Минздравсоцразвития России, г. Челябинск.

Работа поступила в редакцию 12.12.2012.