В последнее время значительно возросла частота злокачественных заболеваний слизистой оболочки рта и губ [3, 6, 10]. Известно, что рак губы диагностируется чаще всего на 3–4 стадиях, поэтому актуальной является ранняя диагностика злокачественного роста, что позволит избежать травмирующих оперативных вмешательств и возможного метастазирования [7]. Морфологическая и клиническая диагностика предраковых состояний очень сложны. С клинической точки зрения к предраковым состояниям относят любые хронические заболевания, сопровождающиеся образованием в тканях очагов избыточной пролиферации клеток, на фоне которых может развиться рак. Основываясь на стандартных способах диагностики опухолевого процесса – определении типа рака губы, стадии заболевания, степени злокачественности ‒ целесообразным является применение новых современных методов и комплексный подход к характеристике опухолевого процесса. Новым подходом может стать изучение ангио- и лимфангиогенеза в пораженном участке по локализации лимфатических сосудов с использованием моноклональных антител.
Целью исследования было морфологическое изучение структуры нижней губы у пациентов с гиперкератозом с выявлением маркеров эндотелиоцитов лимфатических (LYVE-1+) и кровеносных (CD34+) сосудов.
Материал и методы исследования
В исследование были включены 22 пациента с гиперкератозом нижней губы в возрасте от 48 до 93 лет. Среди отмеченных пациентов женщины составляли 9 %, мужчины – 91 %. Средний возраст мужчин был 66,7 ± 5,8 лет, а женщин – 71,5 ± 7,9 лет. Биоптаты нижней губы из очага поражения фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, обрабатывали по стандартной гистологической методике и заливали в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое выявление маркера эндотелиоцитов лимфатических капилляров LYVE-1 и маркера эндотелиоцитов кровеносных сосудов – CD34 проводили на парафиновых срезах толщиной 3–4 мкм. Все этапы иммуногистохимической реакции (депарафинизация, демаскировка, инкубация с первичными антителами и т.д.) проводили в автоматическом режиме на аппарате BENCHMARK/XT (Ventana). Использовали моноклональные антитела к CD34 («Novocastra») и к LYVE-1 («Abcam»). Полученные препараты нижней губы изучали на световом микроскопе «Leiсa DM», фотографировали с помощью компьютерной программы «Аvigion». Микрофотографии морфометрировали с помощью компьютерной программы Image J. Оценивали объемную плотность кровеносных и лимфатических сосудов, численную плотность клеток воспалительного инфильтрата: нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов, плазматических клеток. Использовали закрытую тестовую систему из 315 точек. Цифровые данные обрабатывали с использованием общепринятых методов статистики, вычисляя среднюю арифметическую величину (М), ошибку репрезентативности средней величины (m) и уровень значимости различий средних величин (р) на основании t-критерия Стьюдента для уровня достоверности 95 % (p < 0,05).
Результаты исследования и их обсуждение
При анализе биоптатов пациентов с гиперкератозом нижней губы отмечали крупные кератогиалиновые гранулы в цитоплазме клеток шиповатого слоя эпителия, деструкцию ядер эпителиоцитов, имели место эпителиальные клетки с увеличенными размерами ядер, гипертрофированными ядрышками и клетки в состоянии митоза. Наблюдали пролиферирующие клетки за пределами эпителия. Выявляли воспалительные инфильтраты под эпителием нижней губы. Имела место гетерогенность клеточного состава инфильтратов в зависимости от локализации в пределах очага поражения нижней губы. В среднем в составе инфильтратов было лимфоцитов – 35,44 ± 0,25 %; нейтрофилов – 11,17 ± 0,43 %, плазматических клеток – 19,75 ± 0,63 %; макрофагов – 4,50 ± 0,18 %. В составе инфильтратов могли преобладать плазматические клетки, которые в отдельных участках составляли 90 % от общего числа клеток. В некоторых участках плазматические клетки составляли 68,32 ± 0,78 %; лимфоциты – 15,02 ± 0,42 %; нейтрофилы – 4,55 ± 0,57 %; макрофаги – 2,47 ± 0,24 %.
Просветы кровеносных и лимфатических сосудов были расширены как на границе с очагом поражения нижней губы, так и в пределах воспалительных инфильтратов. Определение объемной плотности CD34+ кровеносных сосудов и LYVE+ лимфатических сосудов позволило выявить преобладание кровеносных сосудов над лимфатическими. Объемная плотность лимфатических сосудов была в 2,4 раза меньше, чем кровеносных (табл. 1).
Таблица 1
Соотношение лимфатических и кровеносных сосудов в переходной зоне нижней губы у пациентов с гиперкератозом при выявлении маркеров LYVE-1 и CD34 (М ± m)
|
Параметры |
Гиперкератоз |
|
Лимфатические сосуды (LYVE-1 +) (Vv) % |
1,84 ± 0,65* |
|
Кровеносные сосуды(CD34 +) (Vv) % |
4,52 ± 1,16 |
|
Vv кровенос. Vv лимфатич. |
2,46 ± 0,33 |
Примечания: Vv – объемная плотность сосудов (%); * – P < 0,05 по сравнению с кровеносными сосудами.
Исследование распределения сосудов в пределах очага поражения нижней губы показало, что наибольшее число кровеносных и лимфатических сосудов расположено в области красной каймы губ (табл. 2). Под эпителием преобладающими были кровеносные сосуды, а в зоне локализации воспалительных инфильтратов в равной мере выявлялись кровеносные и лимфатические сосуды (рис. 1).
Таблица 2
Распределение кровеносных и лимфатических сосудов в переходной зоне нижней губы при гиперкератозе (М ± m)
|
Красная кайма губы |
Соединительнотканные сосочки |
Область воспалительной инфильтрации |
|
|
Кровеносные сосуды (Vv) % |
6,13 ± 1,04 |
4,71 ± 0,82 |
2,05 ± 0,55 |
|
Лимфатические сосуды (Vv) % |
2,03 ± 0,70* |
1,10 ± 0.66* |
1,09 ± 0,62 |
Примечания: Vv – объемная плотность сосудов (%).* – P < 0,05 по сравнению с кровеносными сосудами.
а)
б)
в)
г)
д)
е)
Рис. 1. Иммуногистохимическое выявление кровеносных (CD34 +) и лимфатических (LYVE-1+) сосудов при гиперкератозе нижней губы. Увеличение 10×40:а, в, д – кровеносные (CD34+) cосуды; б, г, е – лимфатические (LYVE-1 +) сосуды а,б – сосуды под эпителием нижней губы; в, г – сосуды в воспалительном инфильтрате; д, е – сосуды, расположенные на уровне красной каймы губы
В области красной каймы нижней губы линии выявляли отдельные LYVE + клетки и группы LYVE + клеток (рис. 2). По морфологии данные клетки определялись как моноциты и макрофаги (см. рис. 2)
По мнению авторов [11], данные клетки могут быть оценены как клетки-предшественники лимфангиогенеза. При иммуногистохимическом выявлении лимфатических сосудов в оболочках глаза было обнаружено большое число LYVE-1+клеток, не относящимся к эндотелиальным клеткам ни по фенотипу, ни по расположению. Фенотипирование данных клеток показало, что они имеют костномозговое происхождение и окрашиваются на маркеры макрофагов. Авторы полагают, что популяции LYVE-1+-макрофагов являются гемопоэтическими предшественниками эндотелиоцитов лимфатических сосудов, при их формировании De novo в условиях патологии [11]. Другими авторами было показано, что LYVE-1 + -клетки являются CD68+-макрофагами и могут быть вовлечены в метаболизм гиалуроновой кислоты и способствовать формированию временных лимфатических каналов при воспалительных процессах [9]. По мнению Kerjaschki D. [5], макрофаги поддерживают лимфангиогенез 2 различными способами – трансдифференцировкой и непосредственным включением в эндотелиальную выстилку сосуда, или стимулируя деление предсуществующих эндотелиальных клеток лимфатических сосудов.
Маркеры кровеносных сосудов известны давно и CD34 признан цитоспецифичным маркёром эндотелия кровеносных сосудов, стабильно присутствующим как в эндотелии крупных и средних сосудов, так и эндотелии капилляров [14]. В последнее время идентифицированы молекулы, которые могут быть использованы как маркеры лимфатического эндотелия, в частности, гиалуронановый рецептор LYVE-1 [1,8,13]. Молекула LYVE-1 располагается на люминальной поверхности стенки лимфатического сосуда и полностью отсутствует в кровеносных сосудах [2]. Выявление LYVE-1 рассматривается как новый лимфатический маркер и новый подход, позволяющий оценить лимфангиогенез [4]. Показано, что плотность лимфатических сосудов (по данным иммуногистохимического анализа) коррелирует с факторами лимфангиогенеза и метастазом в лимфатический узел [12]. В нашем исследовании при использовании иммуногистохимических маркеров кровеносных (CD34+) и лимфатических (LYVE-1) сосудов определена объемная плотность и соотношение сосудов в зависимости от локализации при гиперкератозе нижней губы. Выявлены LYVE-1+-клетки в области красной каймы нижней губы, что возможно связано с образованием новых лимфатических сосудов.
а) 
б) 
Рис. 2. LYVE-1 + клетки в области красной каймы нижней губы при гиперкератозе. Увеличение 10×100:а – одиночные клетки; б – цепочка клеток
Заключение
Гиперкератоз нижней губы характеризуется гетерогенностью клеточного состава воспалительных инфильтратов в очаге поражения. В составе инфильтратов преобладающими являются лимфоциты и плазматические клетки. Иммуногистохимическое выявление маркеров эндотелиоцитов лимфатических сосудов (LYVE-1+) и кровеносных сосудов (CD34+) показало, что в очаге поражения в 2,4 раза больше объемная плотность кровеносных сосудов по сравнению с лимфатическими. Под эпителием нижней губы и в области воспалительных инфильтратов очага поражения объемные плотности кровеносных и лимфатических сосудов достоверно не различаются. В области красной каймы нижней губы отмечено наибольшее содержание не только кровеносных, но и лимфатических сосудов. Выявленные в области красной каймы LYVE + клетки могут быть клетками-предшественниками лимфангиогенеза.
Рецензенты:
Майбородин И.В., д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории стволовой клетки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Центр новых медицинских технологий, г. Новосибирск;
Лушникова Е.Л., д.б.н, профессор, ФГБУ «Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 14.02.2013.