Все организмы находятся под непрерывным влиянием окружающей среды, в том числе минеральных частиц различного размера и формы, присутствующих в атмо-, гидро- и литосфере. Атмосфера Земли содержит более 20 млн т, а 1 м3 самого чистого атмосферного воздуха – не менее 1 млн минеральных взвешенных частиц и взвешенных частиц размером от 0,001 до 1000 мкм [4]. Литр морской воды содержит около 5–6 млн таких частиц [2, 3]. Минеральный состав этих взвесей очень разнообразен. Например, океаническая пыль включает преимущественно галит и сульфаты, а континентальная – кварц, частицы углерода, сульфаты, силикаты, алюмосиликаты, самородное железо, вюстит, сульфиды и другие [1, 4, 5].
Для человека контакт с нано- и микрочастицами минералов заметно возрастает в последнее время. Поэтому изучение биологических эффектов минеральных частиц является актуальной междисциплинарной проблемой, стоящей на границе биологии, геологии, химии и физики.
Настоящая работа представляет результаты по исследованию агрегации тромбоцитов и ферментативного окисления глюкозы из серии работ in vitro, посвященных изучению влияния нано- и микрочастиц α-кварца, полевого шпата, вулканического стекла и апатита на биологические системы.
Материалы и методы исследования
Объекты исследования: полевой шпат (Приморский край), далее Пш, вулканическое стекло (Богатырское месторождение, Приморский край) – Вс, апатит (Кольский полуостров) – Ап, α-кварц (район реки Большая Уссурка, Приморский край) – Ак.
Приготовление нано- и микродисперсных минеральных порошков.
Образцы измельчались в планетарной мельнице Fritsch Pulverisette 4 во втором предустановленном режиме в течение 10 минут (измельчение минералов более 10 минут может приводить к сдвигу кристаллической решетки). Гранулометрический анализ (размерность частиц) полученных порошков определяли при помощи Fritsch Particle Sizer Analysette 22. Для всех образцов размеры подавляющего числа частиц лежали в диапазоне от 100 нм до 20 мкм (полевой шпат – до 25 мкм).
Исследование агрегации тромбоцитов.
Непосредственно перед исследованием из порошков готовили минеральные растворы (0,1 г порошка на 10 мл физиологического раствора), в которых после энергичного непродолжительного встряхивания во взвешенное состояние переходило около 3/4 части от общего объема порошка (визуально), остальная часть сразу оседала. Затем растворы отстаивали 10 минут, после чего верхнюю часть (не более 3 мл суспензии) аккуратно забирали для исследований. Полученные таким образом минеральные суспензии содержали наиболее тонкую фракцию частиц (ex tempore). При отстаивании минеральные частицы суспензий продолжали медленно выпадать в осадок, поэтому перед внесением в плазму суспензии встряхивали.
Влияние суспензий минералов на агрегацию тромбоцитов исследовали на анализаторе агрегации тромбоцитов AP 2110 («Солар», Беларусь), совмещенного с ПЭВМ. В основе принципа работы агрегометра лежит метод светорассеяния (турбидиметрический метод), предложенный Борном. Нами был использован блок светофильтров с маркировкой «А» (спектральный диапазон от 500 до 700 нм). Измерения проводили согласно инструкции к агрегометру с некоторыми изменениями.
Для получения бестромбоцитной и тромбоцитной плазмы кровь брали утром натощак пункцией иглой локтевой вены, самотеком, в пластиковые центрифужные пробирки. Донорами крови были четверо молодых (в возрасте от 25 до 33 лет) практически здоровых мужчин. Для предупреждения свертывания крови в пробирки предварительно вносили по 1 мл 3,8 %-го раствора цитрата натрия (соотношение: 9 мл крови к 1 мл цитрата натрия). Для отделения тромбоцитной плазмы свежую цитратную кровь центрифугировали при 100g в течение 15 минут. Супернатант (тромбоцитная плазма: 330–360 тысяч тромбоцитов на мкл) перемещали в пластиковые пробирки, оставшуюся кровь повторно центрифугировали при 2000 g в течение 15 минут. Надосадок (бестромбоцитная плазма) отбирали в пластиковые пробирки. Стандартизацию плазмы проводили разведением тромбоцитной плазмы бестромбоцитной плазмой до содержания клеток от 200∙109/л до 250∙109/л. В стандартизированной тромбоцитной плазме (далее СТП) исследовали агрегацию тромбоцитов (контрольные и опытные пробы). Анализ плазмы проводили не позднее 3-х часов после забора крови. В качестве индуктора агрегации использовали раствор динатриевой соли аденозин-5`-дифосфорной кислоты (НПО «Ренам», Россия; далее АДФ) в концентрации вызывающей необратимую агрегацию. Рабочий раствор АДФ № 1 содержал 50 мкг АДФ (100 мкМ на 1 мл физиологического раствора). Рабочий раствор АДФ № 2 содержал 100 мкг АДФ (200 мкМ на 1 мл физиологического раствора). СТП прогревали в термостате до 37 °С. В контрольные пробы вносили по 0,45 мл СТП и 0,1 мл рабочего раствора АДФ № 1. В опытные пробы вносили по 0,45 мл СТП, 0,05 мл суспензии минерала (СТП и суспензии минералов не инкубировали) и 0,05 мл рабочего раствора АДФ № 2. Таким образом, конечная концентрация АДФ в контроле и опыте составляла около 10 мкг (20 мкМ).
При добавлении минеральных суспензий в плазму светопоглощение раствора возрастает пропорционально концентрации частиц, что вносит погрешность при сравнении показателей агрегации тромбоцитов в опытной и контрольной плазме. С целью устранения погрешности для контроля и конкретной минеральной суспензии уровень 100 %-го светопропускания устанавливался отдельно. Для контроля это бестромбоцитная плазма, для опыта – бестромбоцитная плазма с добавлением суспензии минерала, соответствующей концентрации.
Исследование сорбции АДФ минеральными порошками.
Способность мелкодисперсных минеральных порошков сорбировать АДФ исследовали на спектрофотометре Unico 2000 (США) при длине волны 259 нм. Для этого в кварцевые кюветы вносили по 3 мл раствора АДФ (около 12,5 мкМ АДФ на 1 мл физиологического раствора) и измеряли оптическую плотность растворов. Затем в опытные кюветы добавляли по 0,1 мл готовых минеральных суспензий (см. выше) и выдерживали при комнатной температуре 5 минут. Затем контрольные и опытные растворы перемещали в центрифужные пластиковые пробирки и центрифугировали в течение 10 минут при 800 g. После центрифугирования аккуратно переносили растворы в кюветы и повторно измеряли оптическую плотность растворов.
Определение электрокинетического потенциала минеральных частиц.
Определение электрокинетического потенциала (z-потенциал) минеральных частиц порошков проводили в электролите (0,9 % раствор NaCl) с использованием прибора Zeta Sizer Nano ZS (Malvern, Великобритания) при температуре 25 °C, фиксированном угле рассеяния 173° и длине волны лазера 633 нм. Анализ частиц проводили после 30-минутного отстаивания раствора.
Исследование ферментативного окисления глюкозы
Использовали набор реагентов Новоглюк-КМ («Вектор-Бест», Россия) и спектрофотометр PV1251С («Солар», Беларусь). Готовые минеральные суспензии по 0,1 мл предварительно вносили в опытные пробирки. Далее по 2 мл рабочего реагента (готовился растворением смеси лиофильно высушенных ферментов в фосфатном буфере) вносили в контрольные и опытные пробирки и измеряли оптическую плотность растворов (длина волны 510 нм). Затем в контрольные и опытные пробирки вносили по 0,02 мл сыворотки (пул сыворотки) и помещали на инкубацию в водяную баню на 25 минут при 37 °С. После инкубации измерение оптической плотности проводили повторно. Для опытных пробирок была также прединкубация 10 и 20 минут с реагентом (до внесения сыворотки) при комнатной температуре.
Статистическая обработка данных проводилась по t-критерию Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Агрегация тромбоцитов человека in vitro.
Минеральные суспензии не проявили свойства индукторов агрегации как при внесении, так и при инкубации с тромбоцитами (максимальная инкубация длилась 1 час при 37 °С). В то же время все суспензии проявили практически одинаковые по силе антиагрегационные свойства (таблица). Так, Пш, Вс, Ак и Ап достоверно снижают уровень максимальной агрегации на 18,1, 25,6, 23,5 и 21,3 % соответственно. Вероятно, данный разброс можно объяснить неоднородностью фракций частиц в помолах.
Влияние суспензий минералов на агрегацию тромбоцитов человека in vitro
Максимальная агрегация, % |
Время максимальной агрегации, с |
Скорость агрегации, %/30 с |
|
Контроль (1) |
54,25 ± 0,77 44,4 ± 0,61 Р1-2 ≤ 0,001 |
193 ± 7,69 207,5 ± 8,81 Р1-2 ≤ 0,01 |
41,2 ± 0,65 41,9 ± 0,77 Р1-2 > 0,5 |
Пш (2) |
|||
Контроль (3) |
75,75 ± 1,33 57,9 ± 0,93 Р3-4 ≤ 0,001 |
217,2 ± 5,74 216,3 ± 4,13 Р3-4 > 0,5 |
67,1 ± 0,58 52,5 ± 1,2 Р3-4 ≤ 0,001 |
Ак (4) |
|||
Контроль (5) |
49,6 ± 0,89 36,9 ± 0,42 Р5-6 ≤ 0,001 |
288 ± 7,3 343,5 ± 7 Р5-6≤0,001 |
38,6 ± 1,2 31,4 ± 0,85 Р5-6 ≤ 0,001 |
Вс (6) |
|||
Контроль (7) |
46,43 ± 0,91 36,5 ± 0,65 Р7-8 ≤ 0,001 |
265,6 ± 5,61 265,8 ± 6,43 Р7-8 > 0,5 |
44,7 ± 0,52 36,5 ± 0,77 Р7-8 ≤ 0,001 |
Ап (8) |
Время достижения максимальной агрегации практически не изменялось при добавлении Пш, Ак и Ап, а при добавлении Вс увеличивалось.
Все суспензии, кроме Вс, практически не изменили время достижения максимума агрегации. Скорость агрегации (уровень агрегации за 30 секунд на наиболее линейном участке) была понижена в пробах с Ак, Вс, Ап, а Пш не изменил данный показатель. Визуально агрегаты в контроле были несколько крупнее. Формы контрольных и опытных агрегатограмм практически не отличаются.
Снижение агрегабельности тромбоцитов под действием суспензий на основе измельченных минералов можно связать с наиболее вероятной причиной – сорбцией. Сорбция минералами тромбоцитов, белков адгезии и агрегации (фибронектин, витронектин, ламинин, фактора фон Виллебранда и др.), АДФ, ионов Сa + + и других тромбоцитарных факторов, присутствующих в реакционной смеси, возможна за счет пористости более крупных минеральных частиц, а также электростатических взаимодействий. Причем по отношению к тромбоцитам крупная фракция минералов, видимо, может выступать в роли сорбента, а мелкая – сорбата.
Нами были определены следующие значения электрокинетического потенциала исследуемых минералов: Пш – 28 ± 5 (мВ), Ак – 27 ± 2, Вс – 36 ± 1 и Ап – 7,1 ± 0,6. Таким образом, z-потенциал минеральных частиц на агрегацию практически не влияют, а наиболее вероятной причиной подавления агрегации может быть сорбция, связанная со структурными особенностями минеральных частиц и их размерами.
С целью проверки возможности сорбции индуктора агрегации (АДФ) минеральными частицами был проведен дополнительный эксперимент, в результате которого установлено, что после инкубации с минеральными частицами и последующего центрифугирования концентрация АДФ снижалась в пробах с Ак в среднем на 7,2 %, Пш – 4,8 %, Вс – 6,4 %, Ап – 5,6 %. Следовательно, приблизительная сорбционная активность минеральных частиц составила около 2,5–3,5 мкМ АДФ на 1 мг порошка. Таким образом, сорбция АДФ частицами имеет место, однако не является единственным объяснением антиагрегационных свойств суспензий. Антиагрегантный эффект минералов также возможен за счет сорбции некоторых белков на поверхности частиц и сорбции самих частиц на поверхности тромбоцитов. В совокупности это может приводить к необратимой адгезии клеток к минералам и одновременно нарушению работы интегринового комплекса, что в итоге препятствует адгезии и агрегации тромбоцитов между собой.
Влияние минеральных суспензий на активность глюкозооксидазы in vitro.
В образцах без прединкубации в сравнении с контролем Ап снизил показатели оптической плотности на 21 %, Вс – 9,8 %, Ак и Пш – 7,5 %. Прединкубация в течение 10 и 20 минут практически не повлияла на данные показатели процесса окисления глюкозы в сыворотке. Поскольку прединкубация минералов проводилась с реагентом, представляющим собой многокомпонентную смесь (ферменты глюкозоксидаза и перкосидза, альбумин), нельзя однозначно сказать, на какой этап (фермент) реакции и в какой степени был оказан эффект минеральных частиц. Также нельзя исключить взаимодействие минеральных частиц с другими компонентами реакционной смеси (глюкоза, фенол, 4-аминоантипирин и др.). Таким образом, говорить о вероятном механизме антиокислительного эффекта минеральных суспензий преждевременно.
Выводы
1. Внесение в плазму исследуемых минералов в виде суспензий выраженно препятствует агрегации тромбоцитов человека in vitro.
2. Внесение минеральных суспензий препятствует окислению глюкозы сыворотки крови под действием глюкозоксидазы in vitro.
Рецензенты:
Бердников П.П., д.б.н., профессор кафедры патологии, морфологии и физиологии, ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет» Министерства сельского хозяйства РФ, г. Благовещенск;
Баталова Т.А., д.б.н., доцент, заведующая кафедрой общей химии, ГБОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ, г. Благовещенск.
Работа поступила в редакцию 17.04.2013.