Системная красная волчанка (СКВ) является заболеванием, развивающимся на основе генетически обусловленного несовершенства иммунорегуляторных процессов, приводящего к возникновению иммунокомплексного воспаления и образованию широкого спектра аутоантител, которые могут быть ответственны за многие клинические проявления, имеющие важное значение в диагностике [3, 4].
Среди множества антител основная роль в развитии и поддержании патологического процесса при СКВ принадлежит антителам к ДНК, образующим с антигенами циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК). В настоящее время основными кандидатами на роль аутоантигена считаются нуклеосомы – комплексы ДНК с гистоном. Предположительно в основе патогенеза СКВ лежит генетически обусловленный дефект апоптоза («запрограммированной клеточной смерти»), способствующий высвобождению нуклеосом из клеток, персистированию и экспансии аутореактивных клонов Т- и В-клеток, приводящих к активации поликлональных В-лимфоцитов и формированию Т-зависимого иммунного ответа на аутоантигены. Контроль апоптоза имеет решающее значение для гомеостаза иммунной системы, а его дефекты играют определенную роль в индукции аутоиммунных заболеваний.
Предполагается, что программированная гибель мононуклеаров является одним из механизмов, приводящих к появлению аутоантигенов и усилению их иммуногенности. Увеличение скорости апоптоза лимфоцитов у больных СКВ было продемонстрировано как in vivo (в периферической крови), так и in vitro [7, 10], причем было отмечено, что данный процесс может сопровождаться возрастанием экскреции из клеток деградированной ДНК, нуклеосом, гистонов, компонентов комплекса Гольджи и митохондрий, а также модификацией и перемещением внутриклеточных макромолекул на поверхность мембраноассоциированных фрагментов (апоптотических телец). Следовательно, апоптотические клетки «поставляют» ранее скрытые аутоантигены, которые активируют аутореактивные лимфоциты, способствуют образованию аутоантител и формируют с ними активированные комплементом иммунные комплексы, откладывающиеся на базальных мембранах. Причем характерный для СКВ широкий спектр аутоантител обусловлен многообразием аутоантигенов, модифицированных и освобожденных в ходе апоптоза [12, 14].
В последнее время особый интерес вызывает тот факт, что достаточно часто мишенью аутоиммунных реакций становятся энзимы основных метаболических путей организма, к которым вырабатываются специфические антитела и их можно определить в сыворотке больных, используя современные высокочувствительные методы лабораторного анализа.
Гуаниндезаминаза (гуанинаминогидралаза, гуаназа, ГДА, Е.С. 3.5.4.3) – один из основных ферментов пуринового метаболизма, относится к группе гидролаз, действует на С–N-связи в структуре N–СН–N циклических аминов и катализирует гидролитическое дезаминирование гуанина с образованием ксантина и аммиака. ГДА сосредоточена в гепатоцитах и железистых клетках, выстилающих внутреннюю поверхность желчного пузыря, островках Лангерганса поджелудочной железы, клетках почечных канальцев и в меньшей степени присутствует в нервных клетках коры головного мозга, бокового желудочка и гиппокампа [13]. Активность гуаниндезаминазы в сыворотке крови человека является в первую очередь индикатором гепатоклеточных повреждений: появление активности фермента в сыворотке крови связано с нарушением функции печени.
Цель исследования: совершенствование методов иммунодиагностики СКВ с помощью иммобилизированных магнитоуправляемых антигенных наносистем (АНС) на основе гуаниндезаминазы.
Материалы и методы исследования
Критерии включения больных СКВ в исследование: возраст 18 лет (включительно) и старше; наличие информированного согласия; наличие у больного диагноза СКВ, соответствующего диагностическим критериям; срок, прошедший после установления диагноза, – не менее 6 месяцев.
Критерии исключения больных СКВ из исследования: беременность или лактация; алкогольная и (или) наркотическая зависимость; инфицирование вирусом иммунодефицита человека или возбудителями вирусных гепатитов В и С; наличие на момент отбора злокачественного новообразования любой локализации; тяжелая сопутствующая патология (сахарный диабет 1 или 2 типа, хроническая сердечная недостаточность 3, 4 функционального класса, хроническая почечная недостаточность в терминальной стадии, дыхательная недостаточность 2, 3 степени), требующая активного лечения.
Была сформирована группа больных СКВ численностью 60 человек, полностью соответствующая представленным критериям. Средний возраст больных СКВ составил 36,32 ± 15,27 (М ± SD) лет, среди больных СКВ преобладали женщины (91,7 %), абсолютное большинство составляли лица трудоспособного возраста (90 %), продолжительность СКВ составила 7,97 ± 7,36 лет, средний возраст дебюта болезни 28,5 ± 13,2 лет.
Активность СКВ оценивалась с помощью индексов SLEDAI (исходный показатель, М ± SD: 8,9 ± 5,7; 95 % доверительный интервал для М – 7,5…10,4) и ECLAM (исходный показатель, М ± SD: 5,3 ± 2,8; 95 % доверительный интервал для М – 4,6…6,0), а также по критериям, предложенным В.А. Насоновой (1985 г.): низкая – 9, умеренная – 34, высокая – 17 человек. Повреждение (необратимые изменения в состоянии здоровья) измерялось с помощью индекса SLICC/ACR (исходный показатель, М ± SD: 1,9 ± 1,7; 95 % доверительный интервал для М – 1,5…2,4).
Контрольную группу составили 30 практически здоровых лиц (17 женщин и 13 мужчин в возрасте от 25 до 47 лет).
Антитела к ГДА (анти-ГДА) определяли в сыворотке крови по модифицированной методике иммуноферментного анализа с использованием иммобилизированных магнитоуправляемых антигенных наносистем (АНС). В качестве антигена использовался коммерческий препарат ГДА («Sigma», США). Иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля (Гонтарь И.П., 2002). Результаты учитывали на многоканальном микропланшетном спектрофотометре при длине волны 450 нм и выражали в единицах оптической плотности (ед.). Результаты считались положительными при превышении в дублированных образцах средних показателей оптической плотности средних значений нормальных сывороток (лиц контрольной группы) не менее чем на 2 стандартных отклонения.
Статистический анализ экспериментальных данных выполнялся с помощью программного пакета «STATISTICA 6.0 FOR WINDOWS» (StatSoft Inc., USA). Уровень статистической значимости различий сравниваемых показателей устанавливали с использованием t-критерия Стьюдента; непараметрического U-критерия Манна‒Уитни и Т-критерия Уилкоксона. Результат считался достоверным при р < 0,05 [5].
Результаты исследованияи их обсуждение
При поступлении на стационарное лечение у больных СКВ (60 человек) показатели уровня антител к ГДА (М ± SD) составили 1,272 ± 0,817 ед. (95 % доверительный интервал для М – 7,5…10,4). У больных СКВ по сравнению со здоровыми лицами было обнаружено увеличение содержания антител к ГДА (p < 0,001; дисперсионный анализ в варианте с неравными дисперсиями). Количество больных СКВ с повышенным уровнем антител к ГДА составило 52 %. Повышенный уровень антител к ГДА не был выявлен ни у одного обследованного в контрольной группе.
Была выявлена статистически значимая корреляция между уровнем антител к ГДА в сыворотке крови больных СКВ и активностью патологического процесса (индекс SLEDAI: r = 0,361, р = 0,012; индекс ECLAM: r = 0,333, р = 0,011). У больных с низкой активностью СКВ антитела к ГДА выявлялись в 22,2 % случаев, в то время как у больных с умеренной активностью − у 41,2 %, а при высокой активности – у 88,2 % больных СКВ. Данное обстоятельство предполагает возможность использования показателей уровня антител к ГДА в качестве дополнительного лабораторного маркера активности патологического процесса при СКВ (таблица).
Содержание антител к ГДА в зависимости от активности СКВ (M; SD)
|
Параметр |
Доноры (n = 30) |
Активность СКВ |
||
|
Низкая (n = 9) |
Умеренная (n = 34) |
Высокая (n = 17) |
||
|
Уровень антител к ГДА (ед.) |
0,032 (0,022) |
0,069 (0,028) |
0,112 (0,063) |
0,171 (0,095) |
Уровень антител к ГДА у больных с умеренной и высокой активностью был значимо выше, чем у больных с низкой активностью СКВ. При дальнейшем сравнении групп между собой были выявлены статистически значимые различия в содержании антител к ГДА между контрольной группой и больными СКВ с высокой активностью (p < 0,001; критерий Даннета), а также между контрольной группой и больными СКВ с умеренной активностью патологического процесса (p = 0,017; критерий Даннета).
Выявление различий между группами больных с различной активностью СКВ по наличию/отсутствию антител к ГДА (Критерий Крускала‒Уоллиса) позволило провести последующие множественные сравнения между данными группами (критерий Даннета). Сравнение больных с различной активностью СКВ, позитивных по антителам к ГДА, продемонстрировало следующие статистически значимые различия: между больными с минимальной и умеренной активностью СКВ (p = 0,039), минимальной и высокой активностью болезни (p = 0,034).
Анализ корреляционных связей антител к ГДА с лабораторными показателями у больных СКВ с минимальной активностью патологического процесса показал достоверную связь умеренной силы с уровнем СОЭ (r = 0,456, р = 0,032) и лейкоцитурией (r = 0,512, р = 0,029). Перед выпиской из стационара содержание антител к ГДА снизилось (F = 15,6; р < 0,0001), но оставалось достоверно выше уровня здоровых лиц (р < 0,001).
У больных с умеренной активностью СКВ была обнаружена корреляция наличия антител к ГДА с уровнем ЦИК (r = 0,684, p = 0,023), уровнем антител к нативной ДНК (r = 0,677, р = 0,017), уровнем антител к денатурированной ДНК (r = 0,402, р = 0,038). Предположительно, антитела к ГДА могут входить в состав циркулирующих иммунных комплексов, что наряду с вовлечением других компонентов в иммунные комплексы может приводить к повышению их уровня у больных СКВ.
После проведенного лечения у больных СКВ с умеренной активностью заболевания отмечена существенная динамика показателей содержания антител к ГДА (F = 81,3; р < 0,001). Содержание изучаемых антител в сыворотке крови больных СКВ данной группы после лечения оставалось достоверно высоким по сравнению с группой доноров (F = 75,5, р < 0,001).
У больных СКВ с высокой активностью патологического процесса уровень антител к ГДА статистически значимо отличался от больных с минимальной активностью (p = 0,008, критерий Даннета) и был сопоставим с уровнем антител у больных с умеренной активностью заболевания (p = 0,281). У больных СКВ данной группы по окончании курса стационарного лечения (по сравнению с поступлением) отмечено достоверное снижение показателей содержания антител к ГДА (р < 0,001).
Кроме того, в группе больных СКВ была отмечена отрицательная корреляция уровня анти-ГДА со значениями биохимической активности гуаниндезаминазы в сыворотке крови (r = –0,35). Наиболее высокие уровни анти-ГДА отмечались у больных СКВ с поражением печени (р = 0,024) и у больных с выраженным цитопеническим синдромом (р = 0,039). Следует подчеркнуть, что в группе больных СКВ, позитивных по анти-ГДА, также статистически значимо чаще выявлялось поражение печени (χ² с поправкой Йетса = 18,95, р = 0,001) и анемия (χ² с поправкой Йетса = 6,92, р = 0,009).
Собственные белки организма в нормальных условиях приводят, как правило, к развитию естественной толерантности, так как основные антигенные детерминанты этих белков распознаются Т-клетками и не могут вызвать образование антител. В случае изменения конформации белка на его поверхности появляются «скрытые эпитопы», то есть такие антигенные детерминанты, которые не участвовали в процессе выработки иммунологической толерантности, а, значит, распознаются как чужеродные антигены [9].
Одной из возможных причин конформационных изменений структуры белка могут явиться активные формы кислорода (АФК) и усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ). Общепризнано, что при СКВ имеет место накопление АФК, вторичных свободнорадикальных продуктов, которые активно реагируют с молекулами в ближайшем окружении [8], а в результате этих процессов происходит усиление пероксидации мембранных структур и нарастание дефектов в контроле апоптоза клеток. Отмечено, что развитие патологических процессов при СКВ сопровождается нарушением регуляции апоптоза лейкоцитов [6] и нейтрофилов [11], причем снижение уровня апоптоза нейтрофилов сопровождается усилением образования активных форм кислорода и уменьшением резервного потенциала клеток [2]. Дефекты апоптоза приводят к усилению секвестрации аутоантигенов в апоптотические тельца, что в итоге способствует срыву толерантности, созданию «новых эпитопов» и, как следствие, увеличению выработки аутоантител.
Чрезмерное образование свободных радикалов при СКВ вызывает повреждение мембран макрофагов, эритроцитов и других клеточных структур [1], а также способствует выходу в экстрацеллюлярное пространство многих биологически активных веществ, в том числе и ферментов. Наличие антигенных свойств у ферментов обеспечивает ответную реакцию при их выходе из клетки, а воздействие различных факторов воспаления усиливает антигенные свойства энзимов вследствие возможного окисления их функциональных групп. Поэтому становится понятной выявленная нами положительная корреляционная связь между активностью СКВ и уровнем антителогенеза к ГДА.
Заключение
Механизмы образования аутоантител при таких заболеваниях, как СКВ, до сих пор не определены. Внедрение инновационных методов лабораторной диагностики на основе АНС может быть использовано для выявления антител к ферментам, в том числе и к ГДА, в сыворотке крови больных СКВ, что позволит более точно судить об активности патологического процесса и даст дополнительные возможности для своевременной коррекции терапевтического воздействия.
Рецензенты:
Краюшкин С.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой амбулаторной и скорой медицинской помощи, ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, г. Волгоград;
Емельянов Д.Н., д.м.н., профессор, зав. кафедрой пропедевтики внутренних болезней, ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, г. Волгоград.
Работа поступила в редакцию 07.05.2013.