Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,441

WOUND-HEALING ACTIVITY OF A GEL WITH THE ACHYROPHORUS MACULATUS L. DENSE EXTRACT

Bubenchikova V.N. 1 Malyutina A.Y. 1 Novikova L.S. 1 Grigoryan A.Y. 1 Zatolokina M.A. 1 Zhilyaeva L.V. 1
1 Kursk State Medical University
Одной из важных проблем медицины на протяжении многих лет остается разработка эффективных методов лечения инфицированных раневых процессов. Заживление раны – сложный биологический процесс, в комплексной терапии которого актуальным направлением является разработка ранозаживляющих средств, обладающих широким спектром фармакологического действия и оказывающих влияние на разные звенья раневого процесса. Для решения этой проблемы нами предлагается гель на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого (Achyrophorus maculatus L.). Цель настоящего исследования состояла в изу­чении ранозаживляющей активности фитогеля густого экстракта травы прозанника крапчатого. В статье представлены результаты по изучению его ранозаживляющей активности посредством планиметрических, микробиологических и гистологических исследований. Полученные результаты позволяют рекомендовать гель на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого в качестве местного противовоспалительного и ранозаживляющего средства.
The development of effective treatments for infected wound healing process is one of the important problems of medicine for many years. Wound healing is a complex of biological process in the treatment of which actual direction is the development of wound-healing drugs that have a wide range of pharmacological actions and influence the different links of wound healing. We propose a gel with the Achyrophorus maculatus L. dense extract to solve this problem. The aim of this investigation was to examine the wound-healing activity of fitogel with the Achyrophorus maculatus L. dense extract. The article presents the results of a study of its wound healing activity by planimetric, microbiological and histological research. The obtained results allow us to recommend a gel with the Achyrophorus maculatus L. dense extract as a topical anti-inflammatory and wound-healing drug.
Achyrophorus maculatus L.
Asteraceae
wound-healing activity
dense extract
1. Babushkina I.V. Saratov Journal of Medical Scientific, 2011, vol. 7, no. 2, pp. 530–533.
2. Bocharova I.G., Avtina N.V., Chestnikova S.Je. Kursk Scientific Practical Journal «Man and his health», 2005, no. 3, pp. 11–15.
3. Gerasimov A.N. Medical statistics: A manual for medical students. M., МИА, 2007. 475 p.
4. Grigoryan A.Yu., Bezhin A.I, Pankrusheva T.A. et al. Kursk Scientific Practical Journal «Man and his health», 2011, no. 4, pp. 24–33.
5. Grigoryan A.Yu., Ivanov A.V., Bezhin A.I. et al. Medical Journal of Trans-Baikal, 2011, no. 2, pp. 132–145.
6. Dementeva D.I. Determination of the water solubility of sodium carboxymethyl cellulose: guidelines. Bijsk, Publisher of Altai State Technical University, 2011. 22 p.
7. Zaharova M.A., Erofeeva L.N., Afonina N.D. et al. Kursk Scientific Practical Journal «Man and his health», 2009, no. 2, pp. 134–142.
8. Khaled, A.Z. Pharmacist, 2002, is. 7, pp. 34–35.
9. Lazarenko V.A., Bezhin A.I., Cherdakov A.V. et al. Kursk Scientific Practical Journal «Man and his health», 2010, no. 2, pp. 5–14.
10. Ogaj M.A., Stepanova Je.F., Larionov L.P., Petrov A.Yu. Bulletin of VSU. Series: Chemistry. Biology. Pharmacy, 2009, no. 2, pp. 171–173.
11. RF Patent № 2009149571/22, 10.06.2010.
12. Plant Resources of the USSR: flowering plants, their chemical composition, the use, the Asteraceae (Compositae) family. St. Petersburg, «Nauka» Press, 1993. рр. 16.
13. Forensic medical histology. A guide for doctors. (Second edition, revised and enlarged) / A.V. Permyakov, V.I. Viter, N.I. Nevolin. Izhevsk-Yekaterinburg, Examination, 2003. 214 p.
14. Tihonov A.I., Yarnyh T.G. Drugs Technology: Textbook for pharmaceutical universities and faculties: Trans. from Ukrainian. / Ed. A. Tikhonov. Kharkov: Publisher KPAU, Golden Pages, 2002. 704 p.

Современная медицина предлагает большое количество методов для терапии раневых процессов различной этиологии, преимущественно обусловленных микрофлорой и развитием воспалительной реакции. Разработано и предложено множество антимикробных препаратов, однако явление резистентности у микроорганизмов к используемым лекарственным препаратам, снижение общей и местной иммунологической активности требуют совершенствования уже имеющихся и поиска новых методов лечения и препаратов, способных оказывать комплексное антибактериальное, противовоспалительное и репаративное воздействие [1, 2].

Незаменимой лекарственной формой в лечении раневых повреждений остаются мази, кремы и гели, интерес к которым в последние годы сильно возрос в связи с новой тенденцией включения в их состав фитопрепаратов разной степени очищенности. Препараты растительного происхождения проявляют себя в качестве основных действующих компонентов. Они оказываю мягкое действие и малую токсичность на фоне высокой эффективности, где комплекс биологически активных веществ оказывает разностороннее и взаимодополняющее действие. Это дает возможность использовать их длительно и без возникновения побочных явлений [10].

В народной медицине трава прозанника крапчатого (Achyrophorus maculatus L.) широко известна как противовоспалительное, антисептическое и ранозаживляющее средство, на чем основано его использование при лечении кожных заболеваний. С этой целью свежие измельченные листья прикладывают к гнойным ранам для их очищения и заживления [12].

Цель данного исследования состояла в изучении ранозаживляющей активности фитогеля густого экстракта травы прозанника крапчатого.

Материалы и методы исследований

Объектом наших исследований явилась трава прозанника крапчатого, заготовленная на территории Курской области в 2012 году в период массового цветения растений, из которых готовили фитогель.

При создании фитогеля большое внимание уделялось подбору компонентов основы, в которую вводились лекарственные вещества. Отсутствие токсичности, соответствие нормам микробиологической чистоты, физиологическая инертность, устойчивость определило наш выбор в пользу 5 % натрий карбоксиметилцеллюлозы (NaКМЦ). Обладая адсорбционными свойствами, как и другие водорастворимые эфиры целлюлозы, NaКМЦ поглощает различного рода выделения поврежденной кожи и создает защитную пленку на ее поверхности [6, 7, 14].

Фитопрепарат готовили из расчета 5 % геля NaКМЦ, в который вводили в различных концентрациях густой экстракт травы прозанника крапчатого.

Установление оптимальной концентрации геля с густым экстрактом исследуемого растения и определение спектра его антимикробной активности осуществляли в опытах in vitro методом диффузии в агар на плотных питательных средах с использованием тест-штаммов микроорганизмов. Чувствительность определяли по отношению к грамположительным (Staphylococcus aureus ATCC 6538-P), грамотрицательным (Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris NCTC 4636 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027) микроорганизмам, спорообразующей культуры Bacillus cereus ATCC 10702. Фунгицидную активность изучали относительно дрожжеподобного гриба рода кандида (Candida albicans ATCC 885-653) [8].

Культуры предварительно выращивали на мясопептонном агаре в течение 24–48 ч. Смыв тест-штаммов микроорганизмов производили стерильным изотоническим раствором натрия хлорида и разводили согласно стандарту мутности Государственного контрольного института медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича до необходимой концентрации 1 млрд микробных тел в 1 мл.

Расплавленные питательные среды охлаждали до (40 ± 1) °С, засевали их со ответствующей тест-культурой и разливали по 10 мл в чашки Петри, установленные на горизонтальной плоскости, затем подсушивали в термостате в течение 30 мин при (37 ± 1) °С. На поверхность засеянной среды помещали на равном расстоянии от края чашки и друг от друга стерильные цилиндры одного размера и массы. В каждый цилиндр вносили по 0,1 г исследуемого образца лекарственного препарата. Выдерживали чашки в течение 1 ч при комнатной температуре для устранения колебаний во времени между внесением экспериментального образца и началом термостатирования. Затем чашки инкубировали в термостате при (36 ± 1) °С в течение 18 ч. По истечении срока инкубации измеряли зоны ингибирования роста тест-штаммов (мм) [4].

Изучение ранозаживляющей активности проводилось в экспериментах in vivo на 54 белых крысах-самцах линии Wistar, в соответствии с Конвенцией по защите животных, используемых в эксперименте и других научных целях, принятой Советом Европы в 1986 г. Для исследования отбирали животных массой 180,0 ± 20,0 г без внешних признаков заболевания, прошедших карантин в виварии ГБОУ ВПО КГМУ. Все животные содержались в одинаковых условиях на стандартном пищевом рационе.

Животным под наркозом моделировалась инфицированная рана, для чего на выбритом от шерсти участке спины без соблюдения стерильных условий иссекали кожу с подкожной клетчаткой размером 15×15 мм. Для стандартизации условий лечения, предупреждения деформации раны, а также для предупреждения высыхания, загрязнения раневой поверхности и укусов другими животными над раной подшивали к коже «Устройство для защиты ран» [9, 11].

В соответствии с поставленной целью и задачами эксперимента животные были разделены на 3 серии по 18 в каждой, из которых контрольной была серия без лечения. В контрольной серии животным производилась только ежедневная обработка раны 3 % раствором перекиси водорода. В серии сравнения (5 % NaКМЦ) ежедневно производилась обработка раны 3 % раствором перекиси водорода и наложение марлевой салфетки с 5 % гелем натрий карбоксиметилцеллюлозы. В серии ‒ 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого (15 % гель) ежедневно производилась обработка раны 3 % раствором перекиси водорода и наложение марлевой салфетки с 15 % гелем на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого. Перевязки экспериментальным животным во всех сериях производили один раз в день, ежедневно в течение 10 суток.

Планиметрические исследования. Для объективной оценки скорости заживления раны по изменению ее площади использовали метод Л.Н. Поповой [4]. Площадь ран определяли следующим образом: на рану накладывали прозрачную пленку, на которую черным маркером наносили ее контур (данную процедуру выполняли поочередно всем исследуемым животным). Определив площадь ран у экспериментальных животных в каждой серии, вычисляли среднюю площадь (M ± m), процент уменьшения площади ран от исходного размера (т.е. процент заживления раны) и скорость заживления ран (т.е. процент уменьшения площади за сутки).

Микробиологическое исследование включало количественное определение микроорганизмов в динамике в 1 г ткани инфильтрата по следующей методике. После выведения животного из эксперимента в стерильных условиях осуществляли забор участка инфильтрата раны массой 0,1–0,5 г, взвешивали и вычисляли коэффициент пересчета на 1 г ткани (К). Затем участок инфильтрата раны растирали в стерильной ступке и суспензировали в изотоническом растворе натрия хлорида из расчета 1:10. Далее делали десятикратные разведения суспензии в изотоническом растворе натрия хлорида до 10–3, а при необходимости и более. Из каждого разведения производили посев 0,1 мл суспензии в чашки Петри с плотной питательной средой (агар). Посевы инкубировали в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 20 ч, затем 1 сут выдерживали при комнатной температуре. После этого производили подсчет колоний, выросших на чашке, и делали соответствующий пересчет на 1 г ткани. Подсчет колоний производили на тех чашках, где колонии росли изолированно и количество их не превышало 300 [4].

Гистологическое изучение раневых биоптатов производили на третьи, седьмые и десятые сутки от начала лечения. Животных выводили из эксперимента путем передозировки эфирного наркоза. Забор материала осуществляли путем иссечения участка мягких тканей дна и прилежащего края раны. Взятый материал сразу фиксировали в 10 % растворе ней трального формалина с последующей проводкой по восходящим спиртам и заливкой в парафин по стандартной методике. Затем изготавливали гистологические срезы толщиной 5–7 мкм. и окрашивали гематоксилином и эозином [5, 13].

Полученные данные обрабатывали статистически посредством электронных таблиц «Microsoft Excel» и «Биостатистика»: вычисляли средние арифметические, стандартное отклонение. Нормальность распределения признаков определяли по критерию Шапиро‒Уилка. Обработку результатов проводили с использованием непараметрических критериев для множественных выборок Крускала‒Уоллиса и Ньюмена‒Кейлса. При уровне значимости p < 0,05 выявленные различия считались статистически значимыми [3].

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ результатов, полученных при микробиологическом исследовании, показал, что наиболее выраженной антимикробной активностью обладает гель на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого в количестве 15 %. За исключением Proteus vulgaris, проявившего умеренную чувствительность к фитопрепарату, все остальные штаммы показали высокую чувствительность.

Из анализа данных по изменению площади ран (табл. 1) следует, что исходные экспериментальные раны у всех животных были сопоставимы по своей площади. С течением времени во всех сериях происходило постепенное уменьшение площади ран в сравнении с предыдущим сроком наблюдения.

Таблица 1

Динамика изменения площади ран у экспериментальных животных в процессе лечения (М ± m)

Серии

Показатель

Исходная площадь

1 сут

3 сут

7 сут

10 сут

n = 18

n = 18

n = 18

n = 12

n = 6

Серия 1

(контрольная)

S раны (мм2)

ПУП* (%)

250,79 ± 0,56

-

250,46 ± 0,43

0,13 ± 0,17

196,17 ± 3,82

21,77 ± 1,55

72,17 ± 2,29

71,32 ± 0,94

21,33 ± 1,86

91,51 ± 0,76

Серия 2

(5 % NaКМЦ)

S раны (мм2)

ПУП (%)

250,04 ± 0,36

-

248,38 ± 0,321

0,66 ± 0,151

172,39 ± 5,201

30,67 ± 2,051

49,00 ± 4,441

80,30 ± 1,781

15,00 ± 3,021

93,98 ± 1,21

Серия 3

(15 % гель)

S раны (мм2)

ПУП (%)

248,83 ± 0,60

-

246,58 ± 0,621

0,90 ± 0,231

171,28 ± 4,321

30,51 ± 1,761

41,67 ± 3,271

83,14 ± 1,331

9,67 ± 1,891,2

96,12 ± 0,761,2

Примечание. ПУП – процент уменьшения площади ран. 1р < 0,05 (сравнивались между собой серия 2 и 3 с серией 1); 2р < 0,05 (сравнивались между собой серия 3 с серией 2).

В сериях 2 и 3 по сравнению с контрольной достоверное различие по проценту уменьшения площади ран отмечается с первых по седьмые сутки, на десятые сутки достоверных различий не выявлено в серии 2. Между сериями 2 и 3 достоверное различие по проценту уменьшения площади ран отмечается только на десятые сутки.

Процент уменьшения площади ран в сериях 2 и 3 близок по значениям в первые и третьи сутки. На седьмые процент уменьшения площади ран в серии 3 на 2,84 % превысил таковой в серии 2 и на 11,82 % – в серии 1.

К десятым суткам от начала лечения в контрольной серии площадь ран уменьшилась на 229,46 мм2, в серии 2 – на 235,04 мм2, в серии 3 – на 239,16 мм2.

Динамика изменения скорости заживления ран в экспериментальных сериях представлена в табл. 2. Из анализа полученных результатов следует, что скорость заживления ран в сериях 2 и 3 по сравнению с контролем достоверно выше на первые-третьи сутки.

Таблица 2

Заживление ран у экспериментальных животных в процессе лечения (М ± m)

Серии

Скорость заживления (%/сут)

1–3 сут

3–7 сут

7–10 сут

n = 18

n = 12

n = 6

Серия 1 (контрольная)

10,80 ± 0,79

12,24 ± 0,51

6,43 ± 0,34

Серия 2 (5 % NaКМЦ)

14,98 ± 0,991

12,95 ± 0,74

4,58 ± 0,70

Серия 3 (15 % гель)

14,89 ± 0,861

13,30 ± 0,53

4,28 ± 0,82

Примечание. 1р < 0,05 (сравнивались между собой серия 2 и 3 с серией 1).

Таким образом, полученные данные планиметрического исследования подтверждают наличие ранозаживляющей активности 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого. Он способствует уменьшению площади ран к десятым суткам более чем на 96 %, тогда как 5 % NaКМЦ показывает уменьшение площади на 93,98 %. Высокая скорость заживления ран в первые семь суток наблюдения свидетельствует об активности фитопрепарата в фазу экссудации.

Результаты микробиологического исследования ран представлены в табл. 3.

Таблица 3

Динамика определения микробной обсемененности ран (M ± m)

Серии

(КОЕ в 1 г ткани)

1 сут

3 сут

7 сут

10 сут

n = 6 (в каждом исследовании)

Серия 1 (контрольная)

4,9 ± 1,01·108

3,7 ± 1,01·108

2,2 ± 0,85·108

1,5 ± 0,33·108

Серия 2 (5 % NaКМЦ)

4,8 ± 0,82·108

3,8 ± 0,72·108

1,9 ± 0,16·108

4,5 ± 1,00·107(1)

Серия 3 (15 % гель)

4,8 ± 0,91·108

9,5 ± 0,95·107(1,2)

4,2 ± 0,18·107(1,2)

10,0 ± 0,01·106(1,2)

Примечание. 1р < 0,05 (сравнивались между собой серия 2 и 3 с серией 1); 2р < 0,05 (сравнивались между собой серия 3 с серией 2).

Во всех сериях микробная обсемененность ран на первые сутки составляла в среднем 4,83 ± 0,92·108 КОЕ/г. В контрольной серии микробная обсемененность ран остается на высоком уровне на всех сроках наблюдения. В серии 2 она достоверно меньше, чем в контрольной, только на десятые сутки и составляет 4,5 ± 1,00·107 КОЕ/г, что в 3,25 раза меньше.

В серии 3 микробная обсемененность ран достоверно меньше относительно контрольной серии и серии 2 на всех сроках наблюдения. К десятым суткам микробная обсемененность достигла 10,0 ± 0,01·106 КОЕ/г, что в 14,65 и 4,5 раза меньше данных, показанных серией 1 и 2 соответственно.

Таким образом, анализ полученных результатов свидетельствует, что использование при лечении инфицированных ран геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого в концентрации 15 % способствует скорейшему уменьшению микробной обсемененности ран по сравнению с использованием 5 % водного геля NaКМЦ и способствует более быстрому заживлению раневой поверхности.

Полученные результаты морфологического исследования показали, что 15 % гель на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого обладает хорошо выраженным стимулирующим эффектом на пролиферативную и функциональную активность клеток грануляционной ткани, который прямо пропорционален сроку эксперимента.

Несмотря на практически полное восстановление эпидермиса, произрастающего от краев раневой поверхности, на отдельных участках частично сохранился струп, в контрольной серии и серии с использованием основы в качестве 5 % раствора NaКМЦ. По визуальной оценке в грануляционной ткани на стандартной единице площади среза наблюдается более высокое содержание клеточных элементов, чем в группе с использованием 15 % геля, что говорит о меньшей степени зрелости этой ткани.

Реактивные изменения дермы, а именно ее клеточная плотность в группах контрольной серии и серии с использованием 5 % раствора NaКМЦ была значительно выше уже на начальных сроках эксперимента в сравнении с группой с использованием 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого, что свидетельствует о более затяжном характере воспалительного процесса, следовательно, и о более длительном заживлении раны.

Относительно большее количество клеток фибробластического ряда у животных с использованием 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого, чем в контрольной серии и серии 5 % раствора NaКМЦ также свидетельствует о повышенной регенераторной активности в этой группе.

Выявленное максимальное количество макрофагов в группах с использованием 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого также свидетельствует об ускорении процессов регенерации, так как макрофаги при репаративных и патологических процессах не только модулируют пролиферативную и синтетическую функции фибробластов, но и путем паракринной стимуляции активизируют миграцию и пролиферацию эндотелиоцитов, процессы ангиогенеза.

Таким образом, использование 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого уменьшает воспалительные изменения, активизирует макрофагальную реакцию, восстанавливает нарушенные межклеточные взаимодействия, усиливает ангиогенез, пролиферацию и дифференцировку фибробластов, синтез и секрецию коллагена, процессы фибриллогенеза, созревание и ремоделирование грануляционной ткани и ее эпителизацию.

Выводы

1. Установлена оптимальная концентрация геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого, оказывающая антибактериальное и стимулирующее действие при заживлении ран, на основании чего определен состав фитопрепарата для терапии раневого процесса.

2. Согласно результатам планиметрического исследования, 15 % гель на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого способствует уменьшению площади ран к десятым суткам более чем на 96 %, тогда как основа – 5 % раствор NaКМЦ показывает уменьшение площади на 93,98 %.

3. Высокую чувствительность к 15 % гелю на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого показали тест-штаммы Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Bacillus cereus ATCC 10702 и Candida albicans ATCC 885-653. В отношении микроорганизмов Proteus vulgaris NCTC 4636 был отмечен умеренный рост, определяющий умеренную чувствительность к исследуемому фитопрепарату.

4. В опытах in vivo 15 % гель на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого оказывал выраженное бактерицидное действие на клетки, что способствует скорейшему уменьшению микробной обсемененности и более быстрому заживлению раневой поверхности. На десятые сутки наблюдения у крыс, получавших лечение 15 % гелем на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого, микробная обсемененность ран снижалась в 14,65 раз по сравнению с контролем без лечения.

5. Исследование морфологической картины репаративной регенерации тканей после моделирования инфицированной раны в контрольной группе и группе, получавшей 5 % гель NaКМЦ, позволяет сделать вывод об эффективности применения 15 % геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого в качестве противовоспалительного и ранозаживляющего средства.

Рецензенты:

Хабаров А.А., д.фарм.н., профессор кафедры общей химии, ГБОУ ВПО «КГМУ», г. Курск;

Сипливая Л.Е., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой фармацевтической, токсикологической и аналитической химии, ГБОУ ВПО «КГМУ», г. Курск.

Работа поступила в редакцию 07.06.2013.