Среди токсических элементов, загрязняющих окружающую среду, по-прежнему пристальное внимание привлекает свинец. Отравления соединениями свинца сопровождаются многочисленными заболеваниями и некоторыми физиологическими состояниями, поэтому изучение структурных и функциональных аспектов свинцовой интоксикации является актуальной задачей [1, 2, 3, 7, 8]. Особый интерес вызывает эмбриотоксическое действие свинца, в первую очередь, его влияние на костную систему потомства. Несмотря на очевидную связь между ростом и формообразованием костей скелета, с одной стороны, и его структурой и метаболизмом, с другой, эти вопросы остаются невыясненными. Решение этой проблемы имеет важное значение для выявления механизмов развития скелета в условиях действия соединений свинца.
Материалы и методы исследования
В эксперименте были использованы половозрелые белые беспородные крысы-самки и их потомство на 1-е, 10-е, 20-е, 30-е, 60-е сутки постнатального периода развития. Данный период отображает рост и процессы формообразования костей скелета. В соответствии с поставленными задачами животные разбивались на две группы. Первую группу животных (контроль) составили крысята от самок с физиологически протекающей беременностью, содержащихся на общем режиме вивария. Вторую группу животных (опыт) составили крысята от самок, получавших с 8-х по 22-е сутки беременности ежедневно перорально ацетат свинца в дозе 45 мг/кг массы тела.
Животные забивались путем декапитации под наркозом эфира с хлороформом с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации, и в соответствии с требованиями правил проведения работ с использованием экспериментальных животных.
Для гистологического исследования выделялись длинные трубчатые кости передних и задних конечностей. Образцы костной ткани фиксировали 10 % раствором формалина и после соответствующей проводки заливали в парафин. Готовили гистологические срезы толщиной 10 мкм, окрашивали их гематоксилин-эозином.
С помощью штангенциркуля по методу Дуерста (1926) с точностью до 0,1 мм измеряли наибольшую ширину дистального эпифиза. С помощью окулярного винтового микрометра МОВ-1-15 и окулярной измерительной системы УМБИ-3 осуществляли морфометрические измерения дистального эпифиза длинных трубчатых костей: измерялись толщина эпифизарного хряща, толщина зоны пролиферирующего хряща, толщина зоны индифферентного хряща, толщина зоны дефинитивного хряща, длина трабекул первичной спонгиозы, количество остеобластов в первичной спонгиозе, количество клеток в столбике зоны пролиферирующего хряща.
Статистическая обработка полученных цифровых данных проводилась с помощью программ FStat и Excel. Проверка статистических гипотез осуществлялась по t-критерию Стьюдента. При оценке статистических гипотез принимались следующие уровни значимости: p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты гистологических и морфометрических исследований показали, что свинцовая интоксикация материнского организма вызывает изменения в механизме роста кости потомства, при этом меняется ее гистологическая картина. Особенно изменения сказываются на зоне роста длинных трубчатых костей.
Известно, что рост кости в длину обеспечивает эпифизарный хрящ, являющийся небольшим участком хрящевой ткани между костным эпифизом и диафизом. Он сохраняется на протяжении всего периода роста кости, и в нем довольно интенсивно происходят процессы репродукции и дифференциации клеток, биосинтеза и минерализации основного межклеточного вещества [4, 5, 6].
В ходе исследования установлено, что у крысят, матери которых получали ацетат свинца в период беременности, толщина эпифизарного хряща (пластинки) меньше, чем у животных в контроле во всех возрастных группах: у новорожденных крысят – на 14,7 % (ρ ≤ 0,001), у 10-суточных крысят – на 24,9 % (ρ ≤ 0,001), у 20-суточных крысят – на 18,9 % (ρ ≤ 0,001), у 30-суточных крысят – на 14,8 % (ρ ≤ 0,001), у 60-суточных крысят – на 29,3 % (ρ ≤ 0,001) соответственно (таблица). Анализируя изменение толщины эпифизарного хряща в возрастном аспекте, можно отметить, что у крысят обеих групп его толщина с возрастом уменьшается. Однако у крысят контрольной группы уменьшение толщины эпифизарного хряща наиболее ярко проявляется к возрасту 30 суток (на 28,6 %), тогда как у крысят опытной группы – к возрасту 60 суток (на 26 %) (таблица). Уменьшение толщины эпифизарного хряща у крысят опытной группы происходит не за счет толщины зоны дефинитивного хряща, а за счет уменьшение толщины зоны пролиферирующего хряща, что свидетельствует о нарушении механизма формирования эпифизарной пластинки.
Морфометрические показатели эпифизарного хряща длинных трубчатых костей белых крыс в разные сроки постнатального периода развития в норме и воздействии ацетата свинца на организм матери
|
Сутки развития |
Толщина эпифизарной пластинки, мкм |
Толщина зоны индифферентного хряща, мкм |
Толщина зоны пролиферирующего хряща, мкм |
Толщина зоны дефинитивного хряща, мкм |
Длина трабекул первичной спонгиозы, мкм |
Количество остеобластов в первичной спонгиозе, шт. |
Количество пролиферирующих клеток в зоне пролиферации, шт. |
|
|
Контроль |
Новорожденные |
235,09 ± 16,00 |
21,65 ± 2,95 |
126,48 ± 10,13 |
86,96 ± 6,64 |
345,08 ± 28,83 |
38,17 ± 3,48 |
10,13 ± 1,68 |
|
10 суток |
224,68 ± 19,0 |
18,56 ± 1,40 |
122,16 ± 2,74 |
83,96 ± 7,60* |
234,01 ± 20,94* |
43,23 ± 4,37 |
13,98 ± 1,19* |
|
|
20 суток |
166,77 ± 13,46* |
16,14 ± 1,29 |
96,29 ± 4,57 |
54,34 ± 5,31* |
97,09 ± 8,95** |
57,87 ± 5,42* |
25,97 ± 2,64** |
|
|
30 суток |
119,09 ± 8,18** |
15,18 ± 1,44 |
65,48 ± 2,43* |
38,43 ± 3,57** |
68,96 ± 5,95** |
89,18 ± 7,48* |
38,19 ± 3,65** |
|
|
60 суток |
106,09 ± 7,47* |
14,90 ± 0,54 |
64,76 ± 5,48 |
29,86 ± 1,50** |
45,78 ± 4,11** |
108,58 ± 9,67* |
45,19 ± 4,00** |
|
|
Опыт |
Новорожденные |
200,54 ± 18,51** |
18,94 ± 1,69 |
109,22 ± 12,68 |
72,38 ± 6,12 |
186,83 ± 15,05 |
27,13 ± 1,68 |
8,17 ± 0,78 |
|
10 суток |
168,91 ± 14,81** |
17,22 ± 1,41 |
85,16 ± 8,73* |
66,53 ± 5,93* |
169,79 ± 12,06 |
31,19 ± 2,78 |
9,48 ± 0,99* |
|
|
20 суток |
135,28 ± 10,81** |
15,68 ± 1,89 |
73,37 ± 6,80* |
46,23 ± 4,76 |
89,04 ± 7,08** |
39,69 ± 3,64** |
18,26 ± 1,46** |
|
|
30 суток |
101,46 ± 8,52** |
14,32 ± 1,36 |
54,02 ± 5,28 |
33,12 ± 3,11 |
54,98 ± 5,16** |
59,68 ± 4,84** |
23,18 ± 1,58** |
|
|
60 суток |
75,02 ± 6,14** |
13,68 ± 1,20 |
39,67 ± 3,65** |
21,67 ± 2,56 |
29,68 ± 2,19** |
84,13 ± 7,69** |
30,50 ± 3,15** |
|
Примечание: * – Р ≤ 0,05, ** – Р ≤ 0,001 по сравнению с животными контрольной группы.
Первой зоной в направлении от эпифиза к диафизу является зона индифферентного хряща. Эта зона отделена сплошной костной пластинкой от костного эпифиза. Клеточные элементы в ней, как правило, размещены в основном межклеточном веществе двумя-тремя неправильными рядами. Хондроциты крысят опытной группы расположены хаотически одиночно, попарно, а ближе к следующей зоне небольшими группами, по 4–5 клеток среднего размера. Форма хондроцитов эллипсовидная или веретенообразная, иногда встречаются клетки округлой формы. В центре хондроцита размещается сферической или округлой формы ядро, окруженное цитоплазмой. Незначительное количество этих клеток имеет ядра сплющенной формы. Границы эпифизарной пластинки неровные и сглаженные.
Морфометрические исследования индифферентного хряща крысят опытной группы показали, что у новорожденных и 60-суточных крысят толщина зоны индифферентного хряща меньше по сравнению с контролем соответственно на 12,5 и 8,2 %. В возрасте 10, 20, 30 суток его толщина незначительно отличается от показателей индифферентного хряща в контрольной группе животных (таблица).
Зона пролиферирующих хондроцитов направлена к диафизу. Пролиферативные процессы в этой зоне предопределяют рост кости в длину, которая обеспечивается как за счет активного роста клеток, так и за счет образования последними коллагена и протеогликанов. Зона представлена хрящевыми клетками, которые имеют клинообразную форму и накладываются одна на одну в виде монетных столбиков, формируя таким образом «колонки» по 12–15 клеток в каждой. Колонки хондроцитов отделены от соседних столбиков прослойками основного вещества с хорошо выраженными фибриллами, которые идут в продольном направлении. У клеток данной зоны выявлены фигуры митозов. Отмечено, что у крысят опытной группы фигуры митозов встречаются одиночно. Среди колонок хондроцитов выявлены расширенные пустоты.
У животных опытной группы толщина зоны пролиферирующего хряща уменьшается в возрастном аспекте и значительно отстает от указанного параметра у 10-, 20- и 60-суточных животных на 30,3 % (ρ ≤ 0,05), 23,8 % (ρ ≤ 0,05) и 38,7 % (ρ ≤ 0,001) по сравнению с животными контрольной группы соответствующих возрастов (таблица).
Количество пролиферирующих клеток, которые имеют высокую пролиферативную активность и находятся на разных стадиях деления, у новорожденных крысят опытной группы меньше на 19,3 %, по сравнению с контролем. У 10-, 20-, 30- и 60-суточных животных, матери которых получали ацетата свинца в период беременности, количество пролиферирующих клеток с возрастом увеличивается, но отстает от контрольных значений на 32,2 %, (р ≤ 0,05), 29,7 %, (р ≤ 0,001), 39,3 % (р ≤ 0,001) и 32,5 % (р ≤ 0,001) соответственно по сравнению с контролем (таблица).
Зона дефинитивного хряща содержит хондроциты разных стадий созревания, которые также организованы в колонки по 5–10 клеток в каждой. Клетки имеют округлую форму и являются большими по размерам, чем хондроциты предыдущей зоны, содержат большое количество цитоплазмы. Ядро занимает центральную часть клетки. Наблюдается значительное количество двуядерных клеток. Фигуры митозов хондроцитов встречаются очень редко в отличие от животных опытной группы, где фигуры митозов не встречаются вообще.
Морфометрические исследования показали, что при свинцовой интоксикации материнского организма у крысят опытной группы толщина зоны дефинитивного хряща меньше по сравнению с животными в контроле. Наибольшая разница на 20,8 % (р ≤ 0,05) и 27,4 % отмечается у 10- и 60-суточных крысят соответственно (таблица).
Зона дефинитивного хряща постепенно сливается со следующей зоной – зоной деструкции. В этой зоне хондроциты размещены в 1–2 ряда. Они приобретают неправильную форму. В большинстве случаев в хондроцитах отсутствуют ядра, цитоплазма местами вакуолизирована. В пустотах этой зоны встречаются эритроциты, эндотелиальные клетки и другие элементы.
У животных, матери которых получали ацетат свинца во время беременности, остатки зоны деструкции сохраняются лишь в периферических областях, которые непосредственно прилегают к перихондральной костной манжетке. Измерить толщину этой зоны довольно сложно, так как она очень тонкая, часть прерывается и не имеет четких границ. В некоторых местах зона деструкции представлена одиночными безъядерными клетками. Вокруг этих клеток межклеточное вещество кальцинируется, вследствие чего разрушаются оболочки клеток, и хондроциты начинают гибнуть.
В зоне остеогенеза или зоне первичной спонгиозы четко прослеживается формирование первичного костного губчатого вещества в виде трабекул, которые приобретают в направлении до дистального конца более согласованную пространственную ориентацию. Между трабекулами находятся остатки хрящевой ткани в виде островков. Ячейки губчатого вещества по размерам мелкие или средние, овальной формы. Костные балки отдалены одна от другой на значительное расстояние.
У животных опытной группы костные балки являются утонченными. Глубина проникновения костных трабекул первичной спонгиозы в костно-мозговую пустоту значительно меньше, чем у животных в контроле. Костномозговой канал непосредственно прилегает к метаэпифизарной пластинке, в нем преобладает желтый костный мозг. При этом наблюдается разреженное расположение костных балок. В разных плоскостях появляются участки некроза, близ которых иногда находятся пустоты в виде щелей. Рядом с последними часто оказываются костные балки с остеоидной тканью. Чаще встречаются старые, чем новообразовавшиеся балки. Остеобласты в этой зоне не пролиферируют.
У крысят опытной группы длина трабекул первичной спонгиозы меньше по сравнению с животными контрольной группы у новорожденных крысят на 45,9 %, у 10-суточных – на 27,4 %, у 20-суточных – на 8,3 % (р ≤ 0,001), у 30-суточных – на 20,3 % (р ≤ 0,001), у 60-суточных – на 35,2 % (р ≤ 0,001) соответственно (таблица). Изучение возрастной динамики длины трабекул показало, что их длина уменьшается от рождения до 60 суток. Однако у животных опытной группы значительное уменьшение длины трабекул первичной спонгиозы происходит, начиная с 20-суточного возраста, тогда как у животных контрольной группы – с 10-суточного, то есть с опозданием на 10 суток (таблица). Эти показатели свидетельствуют об отставании в развитии трабекул у крысят, матери которых получали ацетат свинца.
При исследовании зоны остеогенеза установлено, что в контрольной и опытной группах животных с возрастом увеличивается количество остеобластов (таблица). Однако у животных опытной группы количество остеобластов в первичной спонгиозе меньше по сравнению с животными контрольной группы во всех возрастах, наибольшей разницы достигая у 20- и 30-суточных крысят на 31,4 % (р ≤ 0,001) и 33,1 % (р ≤ 0,001) соответственно (таблица).
Заключение
Исследования показали, что костная система испытывает существенные изменения в процессе развития и жизнедеятельности организма в раннем постнатальном онтогенезе. Это проявляется в перестройке внутренней структуры в процессе развития хряща. Изменения характеризуются определенной направленностью и динамикой в зависимости от экзо- и эндогенных влияний.
Морфометрический анализ показал, что у крысят опытной группы сохраняется общая закономерность уменьшения толщины структур, составляющих эпифизарный хрящ, увеличения количества пролиферирующих клеток в зоне пролиферации, количества остеобластов в первичной спонгиозе в возрастном аспекте.
Установлено, что в условиях свинцовой интоксикации материнского организма у крысят уменьшена длина трабекул первичной спонгиозы, а также снижено количество остеобластов в первичной спонгиозе. Наибольшие изменения испытывает зона пролиферирующего хряща, которая значительно утончена, количество клеток в ней уменьшено. Процесс дифференциации хряща в типичных костных балках резко ухудшается, в связи с чем расширяется зона деструкции эпифизарного хряща трубчатой кости.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отставании процессов развития всех составляющих структур эпифиза трубчатых костей крысят при свинцовой интоксикации материнского организма в период беременности.
Работа проводилась при поддержке Минобрнауки РФ в рамках Программы стратегического развития «Педагогические кадры для инновационной России» (госзадание № 2 от 16.03.2013 г.).
Рецензенты:
Федотова Г.Г., д.б.н., профессор кафедры теории и методики физической культуры и спорта, ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный педагогический институт им. М.Е. Евсевьева», г. Саранск;
Здоровинин В.А., д.в.н., доцент, зав. кафедрой морфологии и физиологии животных, ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», г. Саранск.
Работа поступила в редакцию 10.12.2013.