Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

RESEARCH OF POLYMORPHISMS OF GENES GROWTH FACTORS TO THE DEVELOPMENT OF PRIMARY OPEN-ANGLE GLAUCOMA

Kirilenko M.Y. 1
1 Belgorod State National Research University
Vascular theory of development of the glaucomatous process is currently the most common. One of the most important mechanisms for maintaining blood flow to the optic nerve head is a hemodynamic autoregulation. Significant role in the autoregulation of blood flow plays endothelium producing endothelial (VEGF) and insulin-like (IGF) growth factors. We researched an analysis of association of polymorphisms of endothelial (–460 T/C VEGF-A) and insulin-like growth factor (-G1245A IGF-1) with a predisposition to primary open-angle glaucoma (POAG). Material for the study served as a sample of 453 individuals: 252 patients with primary open-angle glaucoma and 191 people in the control group. Analysis of genetic polymorphisms was performed by polymerase chain reaction (PCR) DNA synthesis. As a result of a comprehensive analysis of alleles and genotypes studied loci of growth factors established association of genotype combinations -1245GA IGF- 1 and allele –460C VEGF-A predisposition to the formation of POAG.
primary open-angle glaucoma (POAG)
PCR analysis
gene polymorphism
endothelial growth factor (VEGF)
insulin-like growth factor (IGF)
1. Egorov E.A. Glaukoma. Nacional’noe rukovodstvo / pod red. E.A. Egorova. M.: GJeOTAR-Media, 2013. 824 р.
2. Nesterov A.P. Glaukoma. M.: Medicina, 2008. 255 р.
3. Nikitin N.A., Kuzbekov Sh.R. Rol’ TGFβ v oftal’mologii // Citokiny i vospalenie. 2009. T. 8, no. 1. рр. 3–9.
4. Ryzhkov I.I. Polimorfizm genov tkanevyh faktorov rosta i ego vlijanie na razvitie i klinicheskoe techenie idiopaticheskogo skolioza: avtoref. dis. ... kand. med. nauk. Belgorod, 2011. 25 p.
5. Bidwell J., Keen L., Gallageher G. Cytokine gene polymorphism in human disease: on-line databases, supplement 1. // Genes Immun. 2001. no. 2. рр. 61–70.
6. Bloor C. A., Knight A. R., Ravindra K. Differential mRNA Expression of Insulin-like Growth Factor-1 Splice Variants in Patients With Idiopathic Pulmonary Fibrosis and Pulmonary Sarcoidosis // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001. Vol. 164, no. 2. рр. 265–272.
7. Ching Y.-H. The Use of growth factors and other humoral agents to accelerate and enhance burn wound healing / Y.-H. Ching, T. L. Sutton, Y. N. Pierpont // Journal of Plastic Surgery. 2011. no. 11. рр. 429–449.
8. Ester W.A., van Meurs J.B., Arends N.J. The -G1245A IGF1 polymorphism is related with small head size and less brain sparing in small for gestational age born children // Eur. J. Endocrinol. 2009. no. 160 (4). рр. 549–55.
9. Favorov A.V. A Gibbs sampler for identification of symmetrically structured, spaced DNA motifs with improved estimation of the signal length / Favorov A.V., Gelfand M. S., Gerasimova A. V. // Bioinformatics. 2005. no. 21. рр. 2240–2245.
10. Flammer J., Orgul S., Costa V. The impact of ocular blood flow in glaucoma // Prog. Ret. Eye Res. 2002. no. 21. рр. 359–393.
11. Ray David, Mishra Manoj, Ralph Shirley Association of the VEGF gene with proliferative diabetic retinopathy but not proteinuria in diabetes. // Diabetes. 2004. no. 53(3). рр. 861–864.
12. Resch H., Garhofer G., Fuchsjager-Mayrl G. Endothelial dysfunction in glaucoma. // Acta Opthalmologica. 2009. no. 87. рр. 4–12.
13. Rivera E. J., Goldin A., Fulmer N. Insulin and insulin-like growth factor expression and function deteriorate with progression of Alzheimer’s disease: Link to brain reductions in acetylcholine // Journal of Alzheimer’s Disease. 2005. рр. 247–268.
14. Szaflik J.P., Wysocki T., Kowalski M. An association between vascular endothelial growth factor gene promoter polymorphisms and diabetic retinopathy // Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 2008. Vol. 246. no. 1. рр. 39–43.
15. AR Sampler, Available at: http://sources.redhat. com/cygwin.

Глаукома – группа хронических заболеваний глаз с различной этиологией, характеризующихся постоянным или периодическим повышением внутриглазного давления (ВГД), вызванных нарушением оттока водянистой влаги, сопровождающихся оптической нейропатией, которая проявляется атрофией зрительного нерва (с экскавацией) и характерными изменениями поля зрения [1]. Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) – наиболее часто встречающаяся форма глаукоматозного процесса, составляет от 72,3 до 96,1 % всех видов глауком [2].

Предложены многочисленные теории патогенеза глаукомной оптической нейропатии (ГОН), в которых снижению кровотока, гипоксии и ишемии в головке зрительного нерва (ГЗН), т.е. сосудистым факторам отводится существенная роль [10]. Одним из важнейших механизмов, поддерживающих кровоток в ГЗН, является ауторегуляция кровообращения в питающих ее сосудах. При колебаниях перфузионного давления именно ауторегуляция контролирует гемодинамику. Значительную роль в ауторегуляции кровообращения играет эндотелий, продуцирующий ряд вазоактивных субстанций, среди которых наибольшее значение придается оксиду азота, эндотелину-1, фактору роста эндотелия сосудов (VEGF) и инсулиноподобному фактор (IGF) [12].

Факторами роста (ФР) называют группу белковых молекул, индуцирующих синтез ДНК в клетке. Подобно гормонам эти факторы обладают широким спектром биологического действия на многие клетки – стимулируют или ингибируют митогенез, хемотаксис и дифференцировку [7]. Установлено что важная роль в этиопатогенезе ПОУГ принадлежит ФР, регулирующим деление, миграцию клеток, экспрессию белка и продукцию ряда ферментов, а также участвующим в процессах репарации, стимулируя ангиогенез и пролиферацию клеток [3]. Гены ФР обладают высокой степенью полиморфизма и ассоциированы с риском развития различных хронических заболеваний [4–6, 13, 14].

Целью нашего исследования явилось изучение ассоциаций полиморфизмов генов эндотелиального фактора роста (-460 T/C VEGF-A) и инсулиноподобного фактора роста (–G1245A IGF-1) у больных ПОУГ.

Материалы и методы исследования

Анализ полиморфизмов генов эндотелиального фактора роста (–460 T/C VEGF-A) и инсулиноподобного фактора роста (–G1245A IGF-1) проводили у 453 индивидуумов: 252 больных первичной открытоугольной глаукомой и 191 человек контрольной группы. Среди больных ПОУГ мужчин было 125 (49,6 %), женщин – 127 (50,4 %) (р > 0,05). В контрольной группе распределение по полу было следующим: мужчины – 93 человека (48,7 %), женщины – 98 (51,3 %) (р > 0,05). Средний возраст больных составил 70,53 ± 8,43 лет (варьировался от 46 до 89 лет), в контрольной группе – 68,55 ± 10,57 лет (варьировался от 48 до 87 лет) (р > 0,05). Таким образом, группа контроля не отличалась от группы больных ПОУГ как по полу, так и по возрасту.

Клиническое, лабораторное и инструментальное обследование индивидуумов изучаемых групп проводилось на базе офтальмологического отделения Областной клинической больницы Святителя Иоасафа г. Белгорода.

Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета. Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 4 мл, взятая из локтевой вены пробанда.

Забор венозной крови производили в пробирки с консервантом, содержащим 0,5 М раствор ЭДТА (рН = 8,0), тщательно перемешивали и хранили при температуре 4 °С не более одной недели.

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществлялось методом фенольно-хлороформной экстракции в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляли 30 мл лизирующего буфера, содержащего 320 г сахарозы, 1 % тритон Х-100, 5 мл MgCl2, 10 мл трис-HCl (pH = 7,6). Полученную смесь перемешивали и центрифугировали при 4 °С, 4000 об/мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспензировали. Затем прибавляли 4 мл ЭДТА-Soline, 400 мкл 10 % SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубировали образец при 40 °С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производили отбор водной фазы. ДНК осаждали из раствора двумя объемами охлажденного 96 % этанола. Сформированную ДНК растворяли в бидистиллированной, деионизованной воде и хранили при –20 °С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза (ПЦР) ДНК.

Анализ генетических полиморфизмов -460 T/C VEGF-A (rs 833061) и –G1245A IGF-1 (rs35767) проводили методом ПЦР синтеза ДНК на амплификаторе CFX-96 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов (для детекции методом TaqMan) [8, 11].

Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди‒Вайберга (HWE), использовали критерий χ2. Об ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к заболеванию судили по величине отношения шансов (OR). Рассчитывался доверительный интервал (CI) – интервал значений, в пределах которого с вероятностью 95 % находится ожидаемое значение рассматриваемого параметра.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программных пакетов «STATISTICA 6.0», «Microsoft Excel 2007», «APSampler/Cygwin».

Результаты исследования и их обсуждение

Изучено распределение полиморфных маркеров генов –460 T/C VEGF-A (rs833061), –G1245A IGF-1 (rs35767) больных ПОУГ и индивидуумов контрольной группы. Результаты анализа ассоциаций данных генетических маркеров с развитием первичной открытоугольной глаукомы представлены в таблице.

Исследование распределения генотипов изучаемых полиморфных маркеров генов показало, что для всех изученных локусов в группе больных ПОУГ и в популяционной выборке эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди‒Вайнберга (p > 0,05). Уровень аллельного разнообразия по изученным локусам составил: от Н0 = 0,24 – для локуса –G1245A IGF-1 до Н0 = 0,49 – для локуса –460 T/C VEGF-A среди больных ПОУГ и от Н0 = 0,31 – для локуса – G1245A IGF-1 до Н0 = 0,51 для локуса –460 T/C VEGF-A в популяционной выборке.

При сравнительном анализе частот генетических вариантов исследуемых полиморфных маркеров достоверных различий между больными ПОУГ и контрольной группой не выявлено (p > 0,05).

В результате проведенного комплексного анализа носительства сочетаний аллелей и генотипов исследуемых локусов факторов роста с помощью программного обеспечения АРSampler [15], использующего метод Монте-Карло марковских цепей и байесовскую непараметрическую статистику [9], установлена ассоциация сочетания генотипа –1245GA IGF-1 и аллеля –460C VEGF-A с формированием предрасположенности к первичной открытоугольной глаукоме. Выявлено, что среди больных ПОУГ частота данного сочетания составляет 24,89 %, что в 1,5 раза превышает аналогичный показатель в контрольной группе (16,57 %). Данная комбинация является фактором риска развития ПОУГ (p = 0,03; ОR = 1,67, 95 % CI 1,02-2,74).

Распределение генотипов, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, индекса фиксации полиморфных маркеров генов факторов роста среди больных ПОУГ и в контрольной группе

Локусы, показатели

Контрольная группа (n = 191)

Больные ПОУГ (n = 252)

-460 T/C VEGF-A (rs833061)

ΣN

179

244

No(Ne)

–460 TT

48 (46,77)

55 (56,10)

–460 TC

87(89,46)

124 (121,80)

–460 CC

44(42,77)

65 (66,10)

χ2(HWE) (p)

0,13 (> 0,05)

0,08 (> 0,05)

Ho (He)

0,49 (0,50)

0,51 (0,50)

–G1245A IGF-1 (rs35767)

ΣN

185

238

No(Ne)

–1245 AA

9 (5,36)

7 (8,13)

–1245 GA

45 (52,27)

74 (71,73)

–1245 GG

131 (127,36)

157 (158,13)

χ2(HWE) (p)

3,58 (> 0,05)

0,24 (> 0,05)

Ho (He)

0,24 (0,28)

0,31 (0,30)

Примечания: ΣN – объем выборки; N0 – наблюдаемое распределение генотипов; NE – ожидаемое распределение генотипов; χ2(HWE) – показатель соответствия наблюдаемого распределения ожидаемому, исходя из равновесия Харди‒Вайнберга; p – достигнутый уровень значимости для χ2(HWE); H0 – наблюдаемая гетерозиготность; HE – ожидаемая гетерозиготность.

Выводы

Генетические полиморфизмы эндотелиального (–460 T/C VEGF-A) и инсулиноподобного фактора роста (–G1245A IGF-1) ассоциированы с формированием заболевания, комбинация генетических вариантов –1245GA IGF-1 и –460C VEGF-A является фактором риска развития первичной открытоугольной глаукомы (OR = 1,67).

Рецензенты:

Чурносов М.И., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой медико-биологических дисциплин Белгородского государственного национального исследовательского университета, г. Белгород;

Сорокина И.Н., д.б.н., профессор кафедры медико-биологических дисциплин Белгородского государственного национального исследовательского университета, г. Белгород.

Работа поступила в редакцию 15.01.2014.