Одним из актуальных направлений экспериментальных и клинических исследований является изучение процессов реиннервации при повреждении периферических нервов [1, 2, 3]. В настоящее время доказана высокая эффективность лазерной допплеровской флоуметрии в диагностике микроциркуляторных нарушений, возникающих при повреждениях периферических нервов [3, 7, 8]. Однако для проведения ряда фундаментальных исследований, в частности при разработке, оценке эффективности и сравнении между собой способов восстановления иннервации, требуется моделировать сдвиги микроциркуляции в условиях эксперимента [2]. В связи с этим целью настоящего исследования являлось установление особенностей изменений микрокровотока и механизмов его модуляции у крыс-самцов при перерезке и нейрорафии седалищного нерва.
Материалы и методы исследования
Экспериментальные исследования выполнены на 15 белых беспородных крысах-самцах массой 200–250 г. При проведении экспериментов на животных соблюдались этические принципы в соответствии с Женевской конвенцией (Geneva, 1990). Всем животным за 5 минут до проведения манипуляций вводилась внутримышечно комбинация золетила («Virbac Sante Animale», Франция) в дозе 0,1 мл/кг и ксилазина («Interchemie», Нидерланды) в дозе 1 мг/кг для достижения наркоза.
Под наркозом обнажали седалищный нерв и производили полную его перерезку на уровне средней трети бедра, после чего осуществляли нейрорафию путём наложения эпипериневральных швов с применением микрохирургической техники, атравматических игл и шовного материала 10/0 или 8/0 USP.
Микроциркуляцию исследовали методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) с помощью компьютеризированного лазерного анализатора микроциркуляции крови «ЛАКК-ОП» (производство НПП «Лазма», Россия) с использованием программы LDF 3.0.2.395. Световодный зонд фиксировали на коже тыльной поверхности стопы. Длительность записи составляла 8 минут. Регистрацию ЛДФ-грамм проводили до оперативного вмешательства, непосредственно после операции, а также на 7, 14 и 21 сутки после перерезки и нейрорафии седалищного нерва.
На первом этапе оценки микроциркуляции рассчитывались показатель перфузии (М) в перфузионных единицах (перф.ед.), его среднеквадратическое отклонение (σ) и коэффициент вариации (Кv). На втором этапе с помощью спектрального вейвлет-анализа проводилось определение абсолютных и нормированных амплитуд эндотелиальных (Аэ), нейрогенных (Ан), миогенных (Ам), пульсовых (Ак) и дыхательных (Ад) осцилляций микрокровотока и показателя шунтирования.
Статистическую обработку данных осуществляли средствами программ MS Excel 2013 и Statis tica 10.0. Большинство наших данных имеют распределение отличное от нормального, поэтому при сравнении групп использовали U-критерий Мана-Уитни.
Результаты исследования и их обсуждение
У белых крыс непосредственно после перерезки и нейрорафии седалищного нерва происходит повышение перфузионного показателя и снижение его среднеквадратического отклонения и коэффициента вариации (табл. 1). При этом отмечается снижение абсолютных величин амплитуд эндотелиальных, нейрогенных и миогенных колебаний, что отражает уменьшение роли активных механизмов в модуляции микрокровотока (табл. 2). Кроме того, выявлено изменение соотношения различных механизмов в модуляции микроциркуляции, что выражается статистически значимым снижением величины показателя шунтирования, определенным как соотношение Ан/Ам (табл. 2). Однако в соответствии с рекомендациями А.И. Крупаткина и В.В. Сидорова [8], такой расчет показателя шунтирования корректен только при доминировании нейрогенных колебаний. В связи с тем, что в спектре ЛДФ-грамм преобладают эндотелиальные колебания, более корректно рассчитывать показатель шунтирования как отношение Аэ/Ам (табл. 2).
Таблица 1
Показатели микроциркуляции при регенерации седалищного нерва у белых крыс в условиях эксперимента
|
Группа |
Показатель перфузии, перф. ед. |
Среднеквадратическое отклонение, перф. ед. |
Коэффициент вариации, % |
|
Контроль |
12,0 (10,5; 13,5) |
0,9 (0,7; 1,3) |
8,8 (5,4; 12) |
|
После операции |
15,0 (14,4; 17,1) p1 = 0,000105 |
0,5 (0,4; 0,8) p1 = 0,008927 |
3,5 (2,5; 5,1) p1 = 0,000622 |
|
7 сутки |
8,5 (6,7; 9,4) p1 = 0,000253; p2 = 0,000016 |
0,6 (0,4; 0,8) p1 = 0,002112; p2 = 0,961083 |
7,25 (4,8; 8,4) p1 = 0,251514; p2 = 0,006767 |
|
14 сутки |
8,25 (7,6; 9,5) p1 = 0,000386; p2 = 0,000020; p3 = 0,862490 |
0,5 (0,4; 0,6) p1 = 0,000141; p2 = 0,329115; p3 = 0,248214 |
5,25 (4,75; 6,85) p1 = 0,017955; p2 = 0,028109; p3 = 0,326349 |
|
21 сутки |
10,4 (9,3; 11,4) p1 = 0,045437; p2 = 0,000057; p3 = 0,012023; p4 = 0,032664 |
0,7 (0,5; 1,0) p1 = 0,038100; p2 = 0,341350; p3 = 0,312322; p4 = 0,028241 |
6,45 (5,1; 9,7) p1 = 0,231901; p2 = 0,014698; p3 = 0,953960; p4 = 0,184210 |
Примечания: в каждом случае приведены медиана, верхний и нижний квартили; p1, p2, p3, p4 – по сравнению с контролем, 1, 7 и 14 сутками после операции соответственно.
Непосредственно после операции у животных обнаружено снижение нормированных амплитуд эндотелиальных и нейрогенных колебаний (табл. 3), что указывает на уменьшение роли этих механизмов в модуляции микрокровотока. В то же время нормированная амплитуда миогенных колебаний у животных непосредственно после операции статистически значимо не изменяется (табл. 3).
Абсолютные величины амплитуд дыхательных и пульсовых колебаний после операционного вмешательства у животных не изменяются относительно уровня контрольных значений (табл. 4), а их нормированные величины статистически значимо увеличиваются по сравнению с контрольными значениями, что свидетельствует об увеличении роли пассивных механизмов в модуляции микрокровотока (табл. 4).
Перфузионный показатель и его среднеквадратическое отклонение у животных на 7-е сутки после операции статистически значимо снижены по сравнению со значениями до и непосредственно после оперативного вмешательства (табл. 1). Анализ состояния механизмов модуляции микрокровотока у крыс-самцов через 7 суток после оперативного вмешательства свидетельствует о снижении абсолютной величины амплитуд эндотелиальных, нейрогенных, миогенных колебаний, а также показателя шунтирования (табл. 2). Одновременно с этим выявлено статистически значимое снижение нормированных амплитуд эндотелиальных и нейрогенных колебаний, но не отмечено изменения нормированной амплитуды миогенных колебаний (табл. 3). В этот период происходит статистически значимое снижение абсолютных амплитуд пульсовых и дыхательных колебаний (табл. 4). Снижение амплитуды пульсовых колебаний характеризует ограничение притока артериальной крови в микроциркуляторное русло, что, вероятно, объясняет снижение показателя перфузии. Следует отметить, что нормированные амплитуды пульсовых и дыхательных колебаний на 7-е сутки после операции находятся в пределах вариабельности контроля (табл. 4), в отличие от уровня этих показателей непосредственно после оперативного вмешательства.
Таблица 2
Активные механизмы модуляции кровотока в системе микроциркуляции при регенерации седалищного нерва у белых крыс в условиях эксперимента
|
Группа |
Максимальная амплитуда колебаний, перф. ед. |
Показатель шунтирования, отн.ед. |
|||
|
Эндоте-лиальных (Аэ) |
Нейрогенных (Ан) |
Миогенных (Ам) |
Ан/Ам |
Аэ/Ам |
|
|
Контроль |
0,44 (0,23; 0,58) |
0,33 (0,25; 0,51) |
0,21 (0,16; 0,27) |
1,63 (1,33; 2,0) |
2,58(1,31; 2,88) |
|
После операции |
0,12 (0,10; 0,20) p1 = 0,000622 |
0,12 (0,09; 0,16) p1 = 0,001130 |
0,13 (0,12; 0,17) p1 = 0,012822 |
1,09 (0,76; 1,17) p1 = 0,000284 |
1,0 (0,76; 1,5) p1 = 0,000262 |
|
7 сутки |
0,11 (0,08; 0,17) p1 = 0,000051; p2 = 0,294136 |
0,10 (0,09; 0,14) p1 = 0,000037; p2 = 0,479239 |
0,11 (0,08; 0,15) p1 = 0,001175; p2 = 0,305508 |
1,05 (0,93; 1,12) p1 = 0,000582; p2 = 0,696271 |
1,04 (0,7; 1,18) p1 = 0,000830; p2 = 0,902909 |
|
14 сутки |
0,09(0,07; 0,10) p1 = 0,000013; p2 = 0,007281; p3 = 0,119034 |
0,10 (0,09; 0,12) p1 = 0,000013; p2 = 0,048133; p3 = 0,386477 |
0,10 (0,08; 011) p1 = 0,000051; p2 = 0,005021; p3 = 0,340779 |
1,0(0,92; 1,17) p1 = 0,002291; p2 = 0,902909; p3 = 0,976970 |
0,89(0,75; 1,06) p1 = 0,000156; p2 = 0,379776; р3 = 0,544371 |
|
21 сутки |
0,19(0,12; 0,27) p1 = 0,006767; p2 = 0,449456; p3 = 0,060603; p4 = 0,004265 |
0,2(0,1; 0,25) p1 = 0,003156; p2 = 0,317167; p3 = 0,049648; p4 = 0,020922 |
0,15(0,11; 0,19) p1 = 0,017955; p2 = 0,807250; p3 = 0,184210; p4 = 0,005584 |
1,21 (1,02; 1,47) p1 = 0,038100; p2 = 0,171858; p3 = 0,126023; p4 = 0,174854 |
1,36(1,00; 1,72) p1 = 0,020463; p2 = 0,150023; p3 = 0,126023; p4 = 0,035090 |
Примечания. Те же, что и в табл. 1.
Таблица 3
Нормированные амплитуды, характеризующие активные механизмы модуляции кровотока в системе микроциркуляции, при регенерации седалищного нерва у белых крыс в условиях эксперимента
|
Группа |
Нормированные амплитуды колебаний, отн.ед. |
||
|
Эндотелиальных |
Нейрогенных |
Миогенных |
|
|
Контроль |
12,41 (10,98; 18,62) |
11,85(9,02; 13,83) |
7,18(5,98; 8,71) |
|
После операции |
8,56 (5,95; 12,66) p1 = 0,025104, |
8,73 (7,10; 10,76) p1 = 0,022532, |
8,95(7,36; 10,76) p1 = 0,097092, |
|
7 сутки |
7,16 (5,29; 9,19) p1 = 0,001648; p2 = 0,129136, |
6,9 (4,95; 9,32) p1 = 0,001393; p2 = 0,179642, |
7,42 (5,97; 9,22) p1 = 0,826200; p2 = 0,213400, |
|
14 сутки |
6,08(4,58; 7,13) p1 = 0,000128; p2 = 0,020463; p3 = 0,260237, |
6,83(5,63; 8,54) p1 = 0,000278; p2 = 0,060299; p3 = 0,707454, |
7,04(5,56; 8,15) p1 = 0,902909; p2 = 0,048133; p3 = 0,707454, |
|
21 сутки |
8,37(6,01; 13,57) p1 = 0,038100; p2 = 0,980536; p3 = 0,340778; p4 = 0,053099, |
8,66(5,68; 11,41) p1 = 0,015721; p2 = 0,902909; p3 = 0,506721; p4 = 0,285477, |
7,44(4,59; 10,06) p1 = 0,826200; p2 = 0,231901; p3 = 0,885234; p4 = 0,623605, |
Примечания. Те же, что и в табл. 1.
Все показатели ЛДФ-грамм у животных на 14 сутки после операции статистически значимо не отличаются от данных, зарегистрированных на 7 сутки (табл. 1, 2, 3, 4), что свидетельствует об отсутствии динамики уровня микрокровотока и активности модулирующих его механизмов в этом временном интервале.
Таблица 4
Пассивные механизмы модуляции кровотока в системе микроциркуляции при регенерации седалищного нерва у белых крыс в условиях эксперимента
|
Группа |
Максимальная амплитуда колебаний, перф. ед. |
Нормированные амплитуды колебаний, отн. ед. |
||
|
Дыхательных |
Пульсовых |
Дыхательных |
Пульсовых |
|
|
Контроль |
0,14 (0,13; 0,17) |
0,09 (0,08; 0,11) |
4,78(4,2; 6,2) |
2,81(2,37; 4,48) |
|
После операции |
0,12 (0,10; 0,15) p1 = 0,101343 |
0,09 (0,08; 0,11) p1 = 0,851934 |
7,89(5,01; 9,51) p1 = 0,001050 |
6,02(3,76; 7,14) p1 = 0,001620 |
|
7 сутки |
0,08 (0,07; 0,13) p1 = 0,016805; p2 = 0,102127 |
0,06(0,06; 0,09) p1 = 0,008416; p2 = 0,009706 |
5,96(3,96; 8,62) p1 = 0,294136; p2 = 0,213400 |
4,33(3,34; 5,28) p1 = 0,112777; p2 = 0,136687 |
|
14 сутки |
0,07 (0,06; 0,09) p1 = 0,000070; p2 = 0,000086; p3 = 0,174854 |
0,06 (0,05; 0,07) p1 = 0,000128; p2 = 0,000116; p3 = 0,133328 |
5,61(4,58; 6,16) p1 = 0,479239; p2 = 0,015721; p3 = 0,470487 |
4,28(3,24; 5,05) p1 = 0,083325; p2 = 0,102127; p3 = 0,750832 |
|
21 сутки |
0,08(0,08; 0,11) p1 = 0,000989; p2 = 0,006767; p3 = 0,885234; p4 = 0,068965 |
0,06(0,05; 0,08) p1 = 0,007830; p2 = 0,008416; p3 = 0,817316; p4 = 0,248214 |
4,73(3,49; 6,21) p1 = 0,75117; p2 = 0,007830; p3 = 0,214495; p4 = 0,370845 |
3,4(2,1; 4,24) p1 = 0,980536; p2 = 0,048133; p3 = 0,214495; p4 = 0,214495 |
Примечания. Те же, что и в табл. 1.
Перфузионный показатель и его среднеквадратическое отклонение у крыс-самцов на 21 сутки после перерезки и нейрорафии ниже уровня контроля, но статистически значимо выше, чем на 14 сутки после оперативного вмешательства (табл. 1). При этом абсолютные значения амплитуд эндотелиальных, нейрогенных и миогенных колебаний также остаются ниже уровня контрольных значений, однако статистически значимо повышаются в сравнении с 14 сутками после операции, что свидетельствует об усилении активных механизмов модуляции микроциркуляции (табл. 2) и, вероятно, отражает начало процесса реиннервации. При расчете показателя шунтирования по формуле Ан/Ам статистически значимой динамики не выявлено, однако имеется статистически значимое увеличение соотношения Аэ/Ам в период с 14 по 21 сутки (табл. 2). В то же время выявлена лишь тенденция, не достигающая статистической значимости, к увеличению нормированных амплитуд осцилляций в эндотелиальном и нейрогенном диапазонах (табл. 3). Статистических различий как абсолютных, так и нормированных амплитуд дыхательных и пульсовых колебаний у животных на 21 по сравнению с 14 сутками после операции (табл. 4) не выявлено.
Полученные данные свидетельствуют, что у крыс-самцов до перерезки и нейрорафии седалищного нерва как абсолютные, так и относительные амплитуды эндотелиальных колебаний преобладают по сравнению с осцилляциями в других регуляторных диапазонах. Эти данные согласуются с нашими предыдущими исследованиями [4, 5, 6, 9]. Однако у клинически здоровых людей различных возрастных групп в вейвлет-спектре ЛДФ-грамм преобладают колебания в нейрогенном диапазоне [3, 7, 8]. Следовательно, соотношение механизмов модуляции микрокровотока кожи у белых крыс отличается от регистрируемых у человека. В этой связи у крыс более корректным является определение показателя шунтирования как соотношение амплитуд эндотелиальных и миогенных колебаний (Аэ/Ам) [8]. Полученные данные свидетельствуют о том, что при оценке развивающихся денервационных нарушений микроциркуляции способ расчета показателя шунтирования принципиального значения не имеет. Однако при оценке начала процесса реиннервации соотношение Аэ/Ам более информативно, поэтому именно такой способ расчета показателя шунтирования является предпочтительным для данной модели.
Согласно данным А.И. Крупаткина и соавторов у больных с полным анатомическим перерывом нервов отличительными признаками изменений кожного кровотока в зоне их иннервации является снижение нормированных амплитуд осцилляций в нейрогенном и миогенном диапазоне, что отражает повышение нейрогенного и миогенного тонуса сосудов микроциркуляции и снижение показателя шунтирования, отражающее спазм артерио-венулярных шунтов [3, 7, 8]. Следовательно, у животных при перерезке и нейрорафии седалищного нерва аналогично изменениям у больных с травмами периферических нервов развивается гиперчувствительность сосудов в денервированном участке кожи. Однако у белых крыс в отличие от людей при повреждении нерва не происходит снижения нормированных амплитуд миогенных колебаний, что может быть обусловлено как видовыми особенностями, так и влиянием наркоза.
Заключение
Изменения микроциркуляции у белых крыс при перерезке и нейрорафии седалищного нерва аналогичны и гомологичны нарушениям, возникающим у больных при повреждении периферических нервов, что позволяет использовать данную модель при изучении регенерации нервной ткани. К числу особенностей, выявляемых у животных при перерезке и нейрорафии седалищного нерва, в отличие от пациентов с травмами периферических нервов, относится отсутствие значимого снижения нормированной амплитуды колебаний в миогенном диапазоне, что следует учитывать при использовании данной модели в условиях эксперимента.
Рецензенты:Антипова О.Н., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии им. И.А. Чуевского, ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, г. Саратов;
Афанасьева Г.А., д.м.н., заведующая кафедрой патологической физиологии, ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, г. Саратов.