Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Диагностика рассеянного склероза (РС) не вызывает затруднений у лиц молодого возраста с типичной клинической картиной и характерными признаками параклинических методов исследования. Тем не менее невролог в практической работе встречается с необходимостью оценки течения заболевания, проведения дифференциальной диагностики РС с клинически сходными заболеваниями нервной системы сосудистого, дисметаболического, дегенеративного, аутоиммунного и иного генеза. Учитывая, что проявления рассеянного склероза имеют индивидуальные особенности с непрогнозируемыми периодами обострения заболевания [1, 5], разработка новых методов лабораторной диагностики РС, позволяющих получить дополнительную информацию о развитии заболевания на основе оценки состояния отдельных звеньев и систем, участвующих в иммунопатологических механизмах, имеет актуальное значение в условиях становления персонифицированной медицины.

Накапливаются данные об активном участии системы естественной цитотоксичности в реализации воспалительных и аутоиммунных реакций при РС [2, 6, 7]. Большой гранулярный лимфоцит (БГЛ) как представитель данной системы, имеющий определенные иммунологические и морфологические характеристики, связан с механизмами аминорегуляции [4]. Его способность к депонированию и высвобождению биогенных аминов в условиях аминорегуляции сочетается с ультраструктурной и морфологической перестройкой. К числу информативных морфометрических критериев перехода лимфоидных клеток в иное функциональное состояние [3] относится изменение размеров клетки, ядра, возможная динамика цитоплазменно-ядерных отношений (ЦЯО), отражающих компенсаторные процессы в клетке.

Цель исследования: определить морфофункциональное состояние (МФС) больших гранулярных лимфоцитов и на основе их интегральной оценки разработать дополнительный метод для диагностики рассеянного склероза.

Материал и методы исследования

Под наблюдением находилось 27 больных рассеянным склерозом с ремиттирующим (РРС) и вторично-прогрессирующим течением (ВПРС) в возрасте от 26 до 45 лет с длительностью заболевания от 2 до 18 лет. Показатель инвалидизации больных по шкале EDSS составил 4,31 + 0,36 балла. Контрольная группа пациентов состояла из 16 доноров и 19 пациентов в возрасте от 20 до 52 лет с другими неврологическими заболеваниями (ДНЗ) сосудистого, вертеброгенного генеза, нейродегенеративной патологией, имеющими клиническое сходство с рассеянным склерозом на определенном этапе своего развития и вызвавшими затруднения в процессе диагностики. В обследовании приняли участие лица обоего пола.

Материалом для лабораторного исследования служила гепаринизированная венозная кровь, взятая натощак. Фракция мононуклеарных клеток выделялась общепринятым способом с использованием градиента плотности фиколл-верографин фирмы «Pharmacia Chemical» (Uppsala, Sweden). Взвесь мононуклеарных клеток в концентрации 2·106 кл. в 1 мл среды 199 инкубировалась 40 мин при t – 37 °С в 10–4 М растворе креатинин-сульфата серотонина. Материалом для морфометрии служили мазки, приготовленные из взвеси мононуклеарных клеток, полученных после обработки гистохимическим методом Севки и окраской по Романовскому-Гимза. Морфометрия БГЛ (от 45 клеток в каждой группе исследований) проводилась с использованием правила случайной выборки и включала в себя измерение линейных размеров цитоплазмы и ядра клеток в 2-х взаимоперпендикулярных осях с помощью окуляр-микрометра МОВ-1-15х. Полученные данные подвергались математической обработке по программе вычисления стереометрических показателей: объем клетки (Vкл), объем ядра (Vяд). Цитоплазмо -ядерное отношение (ЦЯО) определялось по формуле: (Vкл – Vяд)\Vяд. Расчет статистических данных включал: среднее арифметическое значение показателей (Х), стандартное отклонение (s). Определение статистической значимости различий выборок проводилось с помощью параметрического критерия Стъюдента. Корреляционный анализ признаков внутри группы проводился методом ранговых корреляций Спирмена. Для математического моделирования использовался системный многофакторный анализ, в основе которого лежит вычисление интегральных показателей (ХBi ± si) по полученным в процессе исследования единичным параметрам [3]. Степень влияния единичных параметров на систему, за которую принят большой гранулярный лимфоцит с комплексом морфометрических данных при нагрузке серотонином, оценивалась весовым коэффициентом (Рi).

Результаты исследования и их обсуждение

Для сравнительной характеристики были выделены группы больных с различным течением РС и ДНЗ. В группе доноров объем клеток составлял 267,3 ± 9,7 мкм, что было заметно меньше (p < 0,05), чем в группах больных рассеянным склерозом (таблица); объем ядра составил – 144,9 ± 6,5 мкм; ЦЯО – 0,95. Идентичность ЦЯО БГЛ – как одного из признаков активации морфофизиологических процессов клетки при сравнении групп доноров и больных ДНЗ дает основание предполагать ограниченную роль этой популяции лимфоцитов в формировании иммунной дисфункции при ДНЗ. Показатели объема клеток у больных РС были выше, достигая статистически значимых различий при ремиттирующем течении (p < 0,05) в сравнении с данными больных с ДНЗ.

Большие величины объема клетки БГЛ в нагрузочном тесте с серотонином при РС в сравнении с контрольными группами подтверждают их активацию и роль в механизмах амиинорегуляции при этом заболевании. Объем ядра БГЛ больных с различным течением РС также превышал аналогичный показатель доноров и пациентов с ДНЗ, особенно в стадии обострения заболевания (p < 0,05). Цитоплазмо-ядерные отношения БГЛ больных с РРС в стадии ремиссии и ВПРС отличались более высокими значениями в сравнении с данными доноров и ДНЗ. В сравнении со стадией ремиссии при РРС период обострения заболевания характеризовался меньшими морфометрическими показателями ядра БГЛ, ЦЯО. У больных со вторично-прогрессирующим течением РС в сравнении с ремиттирующим течением объем клетки и ядра БГЛ был существенно меньше. Однако их показатели имели определенное сходство с данными группы ДНЗ, что может указывать на меньшую морфофункциональную активность этой популяции лимфоцитов в реализации иммунопатологических реакций при ВПРС. У больных с ремиттирующим течением РС отмечались большие значения стандартных отклонений, особенно в стадию ремиссии, что подтверждает неоднородность функциональной активности БГЛ в этот период заболевания и может быть проявлением отражения клинико-иммунологической гетерогенности РС. При сравнительной внутри-групповой оценке показателей возраста, пола, уровня поражения нервной системы, длительности течения заболевания, показателя инвалидизации с морфометрическими данными БГЛ у больных РС с различным течением заболевания значимых изменений не выявлено.

Для определения диагностической ценности полученных результатов проведено математическое моделирование МФС БГЛ. Наибольшие значения интегрального показателя, характеризующего степень изменения МФС БГЛ, были отмечены у больных РС при сопоставлении с группой ДНЗ, где он носил отрицательное значение. Если у больных РС на результат интегрального показателя согласно коэффициенту (Pi) доминирующее влияние оказывал объем клетки и ЦЯО БГЛ, то у пациентов с ДНЗ это был объем клетки и ядра.

Средние значения, коэффициент влияния и интегральные показатели МФС БГЛ у больных РС и ДНЗ

Примечание. Объемы (V) клетки, ядра (V) измерялись в мкм3.

Высокие среднеквадратичные отклонения (si) расчетной величины интегрального показателя у больных РС свидетельствуют о большей динамичности системы, неоднородном функциональном состоянии этих клеток и, следовательно, различной степени участия в иммунных процессах при РС и ДНЗ. Это дает основание использовать анализируемые данные для дифференциальной диагностики РС с другой патологией нервной системы. Полученные интегральные показатели МФС БГЛ были неодинаковы в моделях как в группах больных РС с различным течением, так и при ДНЗ. Это создало предпосылки для разработки математических моделей МФС БГЛ, предлагаемых в практику. Анализ показателей весовых коэффициентов позволил внести в работу по математическому моделированию МФС БГЛ значения объема клетки и ядра. Полученные интегральные показатели (ХBi ± si) МФС БГЛ для практического применения у больных РС были выше, чем в расчетных (теоретических) моделях , за исключением пациентов с ДНЗ, что подчеркивает информативность моделей для дополнительной диагностики РС.

В завершении математического моделирования была создана графическая матрица интегральных показателей МФС БГЛ (рисунок). Как видно из рисунка, матрицы (ХBi ± si) для оценки МФС БГЛ при РС и ДНЗ не имеют зон совмещения, что свидетельствует о высокой их дискриминирующей способности для клинико-лабораторной диагностики РС.

Отмечалось частичное совмещение зон между интегральными показателями МФС БГЛ у больных РС с ремиттирующим течением в стадии обострения и ремиссии. Такое состояние, возможно, связано с идентичностью их морфофункциональных характеристик и серотонинергической регуляцией БГЛ на определенном этапе развития РРС. Тем не менее сохраняется высокая диагностическая ценность вычисленных интегральных показателей МФС БГЛ в практической модели.

Матрица интегральных показателей (ХBi ± si) морфофункционального состояния БГЛ у неврологических больных (горизонтальная ось их значения): А – РРС стадия ремиссии; C – РРС стадия обострения; D – ВПРС; E – ДНЗ

Заключение

Таким образом, разработанные математические модели морфофункционального состояния больших гранулярных лимфоцитов отражают различную степень их активности в иммунных реакциях при РС и ДНЗ. Выявленная дискриминирующая способность нагрузочного теста с серотонином в оценке МФС БГЛ подтверждает, что серотонинергическая регуляция функции клеток системы естественной цитотоксичности принимает участие в патогенетических механизмах развития заболевания. Разработанный метод дополнительной клинико-лабораторной диагностики РС может применяться в практическом здравоохранении.

Рецензенты:

Кухтевич И.И., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой неврологии, ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Минздрава России, г. Пенза;

Калуцкий П.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Курск.

Работа поступила в редакцию 04.04.2014.