Исследование трансформации тяжелых металлов после их поступления в клетку является важной задачей экологической химии. Одним из агентов, принимающих участие в детоксикации поступающих поллютантов, является глутатион [5]. Постановка модельных экспериментов по изучению взаимодействия глутатиона с ионами меди(II), определению состава, устойчивости этих комплексов и их токсичности является актуальной задачей. Сложность изучения взаимодействия акваионов меди (II) с глутатионом заключается в том, что данный лиганд достаточно легко подвергается процессу окислительной димеризации, приводящей к образованию соответствующего продукта окисления со связью S–S, обладающего лигандными свойствами, в то время как ионы [Cu(H₂O)₆]²⁺ обладают окислительными свойствами и могут превращаться в комплексные соединения Сu (I). В присутствии кислорода воздуха возможно окисление Сu (I) и, как показано в литературе [13], образование продуктов активации молекулярного кислорода, в частности супероксид анион-радикала О₂^–•. Это приводит к сложности однозначной интерпретации полученных экспериментальных данных. В частности, из-за этого отсутствуют систематизированные данные по исследованию состава, физико-химических свойств и токсичности комплексных соединений глутатиона с медью (II). Актуальность данного исследования определяется ролью глутатиона в живых организмах в процессе детоксикации соединений тяжёлых металлов и поддержания редокс-статуса клетки. Поэтому целью работы было исследование водных растворов с различным мольным соотношением сульфата меди (II) и глутатиона методами физико-химического и биологического анализов.

Материалы и методы исследования

Концентрации для приготовления исходных растворов выбирали с учётом растворимости образующихся соединений и рабочего интервала концентраций определяемых веществ на используемых приборах.

Образование комплексных соединений меди с глутатионом определяли методом потенциометрического и инверсионного вольтамперометрического титрования раствора сульфата меди (II) с концентрацией 1∙10^–5 М раствором глутатиона с концентрацией 0,0005 М в анаэробных условиях (аргон). При потенциометрическом титровании регистрировали изменение э.д.с. на pH-метре-иономере «Эксперт-001» с медь-селективным электродом марки ЭЛИС-131, а при инверсионно-вольтамперометрическом титровании – площади пика глутатиона на вольтамперограммах, снятых на приборе «Экотест-ВА» с дисковым вращающимся электродом [7]. Методом электронной спектроскопии поглощения, используя способ изомолярных серий, исследовали растворы в соотношениях Cu(II):GSH равных 9:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:9 [1, 11]. Ультрафиолетовые спектры растворов снимали на однолучевом сканирующем спектрофотометре UNICO 2800 в интервале длин волн от 190 до 250 нм. При более высоких длинах волн ультрафиолета и в видимой части спектра пиков не наблюдали.

Три типа растворов, содержащих соль меди(II) в смеси с глутатионом в мольном соотношениях Cu(II):GSH, равных 1:0, 1:1 и 1:4 (содержание меди (II) во всех растворах одинаковое и равно 0,64 мг/дм3), протестировали биолюминесцентным и тетразольно-топографическим методами [2, 8] на культуре Nostoc linckia 273 (титр = 9,5∙10⁹ кл/см3) из коллекции кафедры биологии растений, селекции и семеноводства, микробиологии Вятской государственной сельскохозяйственной академии. Почвенные цианобактерии Nostoc linckia 273 перспективны для использования в качестве биотест-организмов при загрязнении окружающей среды соединениями тяжёлых металлов.

Результаты исследования и их обсуждение

Данные, полученные методом спектрофотометрии, не дали сведений о составе соединений меди с глутатионом, но позволили выявить область соотношений, в которой наблюдается существование комплексов. Соединения начинают образовываться при мольном соотношении исходных веществ в смеси Cu:GSH, равном 2. При увеличении доли глутатиона доля оптической плотности, приходящейся на образующиеся соединения, возрастает и достигает максимума при соотношении 1:6. Область длин волн, в которой возможно зафиксировать образование комплексов лежит от 190 до 217 нм (рис. 1).

Рис. 1. Влияние состава растворов и длины волны на оптическую плотность раствора (график построен по данным, относящимся только к образующимся соединениям, и не учитывает оптическую плотность, обусловленную исходными соединениями)

Для подтверждения и уточнения данных, полученных методом спектрофотометрии, применены методы потенциометрического и инверсионно-вольтамперометрического титрования.

Данные, полученные этими двумя электрохимическими методами, подтвердили результаты спектрофотометрии относительно того, что в водном растворе при постепенном увеличении доли глутатиона первым образуется комплекс из раствора с мольным соотношением иона меди к лиганду, равным 1.

На графиках (рис. 2, 3) видно, что при прибавлении раствора глутатиона в количествах, создающих мольные соотношения с медью (II), равные 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 и 1:6, возникают изменения измеряемых параметров. При потенциометрическом титровании наблюдается увеличение отношения dE/dV, а при инверсионно-вольтамперометрическом – уменьшение площади пика свободного глутатиона на вольтамперограмме, что свидетельствует об образовании соединения. В растворах, где на одну молекулу GSH приходится несколько ионов меди (II), таких изменений не обнаружено.

Рис. 2. Кривая потенциометрического титрования 1∙10^–5 М раствора сульфата меди (II) 0,0005 М раствором глутатиона

Рис. 3. Кривая инверсионно-вольтамперометрического титрования 1∙10^–5 М раствора сульфата меди (II) 0,0005 М раствором глутатиона

Литературные данные, свидетельствующие об обменном механизме реакции между медью (II) и глутатионом [4, 12], позволяют предположить, что выявленные изменения обусловлены ступенчатым образованием комплексных соединений между медью (II) и глутатионом. В этом случае по результатам потенциометрического и инверсионно-вольтамперометрического титрования можно рассчитать константы устойчивости медьсодержащих комплексов глутатиона различного состава (таблица). Согласно численным значениям констант данные соединения относятся к относительно термодинамически устойчивым комплексам.

Значения lgk комплексов меди с глутатионом различного состава

В растворе без глутатиона концентрация ионов меди 0,64 мг/дм3. При добавлении глутатиона до мольного соотношения с медью 1:1 исходная концентрация меди (ІІ) уменьшается в два раза, а при добавлении пептида до соотношения 1:6 – уже в 60 раз. Соответственно, при увеличении доли глутатиона, должен уменьшаться обусловленный медью (II) токсический эффект.

Для выявления влияния глутатиона на токсичность соли меди (II), были протестированы растворы с мольными соотношениями Cu:GSH равными 1:0, 1:1 и 1:4 (рис. 4 и 5).

Достоверных различий между вариантами при исследовании тетразольно-топографическим методом не обнаружено, но есть тенденция: с увеличением количества глутатиона в растворе уменьшается содержание формазана в клетках ЦБ, указывающее на увеличение токсичности (рис. 4). Данные, полученные в результате исследования биохемилюминесценции, показывают, что при увеличении содержания глутатиона увеличивается ИБХЛ культуры, что, скорее всего, также связано с усилением токсичности. Однако известно, что лиганд (глутатион) является важнейшим компонентом всех живых систем, и увеличение токсичности за его счёт маловероятно. Одна из функций глутатиона – защита организма от действия ТМ, а результаты исследований показывают увеличение токсичности с ростом его концентрации.

Рис. 4. Влияние соединений меди (II) на накопление формазана клетками цианобактерий Nostoc linckia 273: 1 – контроль (вода); 2 – Сu ²⁺ ; 3 – Сu:GSH – 1:1; 4 – Сu:GSH – 1:4

Рис. 5. Влияние соединений меди (II) на интенсивность биохемилюминесценции цианобактерий Nostoc linckia 273: 1 – контроль (вода); 2 – Сu ²⁺ ; 3 – Сu:GSH – 1:1; 4 – Сu:GSH – 1:4

Анализ суспензии ЦБ показал, что с увеличением доли глутатиона в растворе появляется тенденция к увеличению содержания меди как в лиофобной, так и лиофильной фракциях клеток культуры, в большей степени в лиофильной (без глутатиона – 24 ± 8 мкг; 1:1 – 33 ± 11 мкг и 1:4 – 44 ± 14 мкг в лиофильной фракции; 74 ± 22; 77 ± 23; 96 ± 29 мкг соответственно в лиофобной фракции). Вероятнее всего, глутатион повышает биодоступность меди, и чем выше доля глутатиона в растворе, тем больше меди обнаружено в клетках. Соответственно, чем больше меди внутри клеток, тем токсичнее оказываются растворы согласно результатам тетразольно-топографического метода и тем интенсивнее биолюминесценция. Соединения меди с органическими лигандами усиливают биолюминесценцию за счет образования комплексов с кислородом и продуктами его активации [3, 10]. В частности, присоединение молекулярного кислорода к комплексам меди приводит, в зависимости от природы органического лиганда, к тому, что образуются соединения Cu(II) с супероксид анион-радикалом О₂^–• или соединения Cu(III) с пероксидным анионом О₂^2– [14]. Радикалы окисляют компоненты клетки, в ходе этих реакций выделяется энергия, обусловливающая увеличение люминесценции [6].

Выводы

1. Установлено, что при приливании раствора глутатиона мольных соотношениях с медью (II) 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 и 1:6 в анаэробных условиях возникают резкие изменения измеряемых параметров: в потенциометрическом титровании увеличение dE/dV, а в инверсионно-вольтамперометрическом – уменьшение площади пика глутатиона восстановленного на вольтамперограмме, что свидетельствует о том, что в данный момент образовалось какое-то соединение. В растворах, где на одну молекулу GSH приходится несколько ионов меди, таких изменений не происходит. Рассчитанные значения констант устойчивости свидетельствуют об образовании относительно термодинамически устойчивых комплексов.
2. Выявлено, что глутатион способствует повышению биологической доступности меди (ІІ), особенно в тех соединениях, где доля глутатиона выше.
3. Глутатион может обеспечивать в организме накопление соединений меди (ІІ) и наоборот, недоступное для организма количество металла глутатион может сделать доступным.
4. Явление усиления биодоступности меди за счет образования комплексов с глутатионом следует учитывать при выборе тест-объектов при проведении биотестирования.

Рецензенты:

Алемасова А.С., д.х.н., профессор, заведующая кафедрой аналитической химии Донецкого национального университета Министерства образования и науки Украины, г. Донецк;

Воробьёв-Десятовский Н.В., д.х.н., профессор, начальник Управления ЗОА «Полиметалл Инжиниринг», г. Санкт-Петербург.

Работа поступила в редакцию 10.07.2014.