Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

LOCAL IMMUNITY CHANGES IN PATIENTS WITH ENDOMETRIOID OVARIAN CYSTS ON THE BACKGROUND OF UNDIFFERENTIATED CONNECTIVE TISSUE DYSPLASIA

Aleksanova E.M. 1 Aksenenko V.A. 1 Pilavova O.M. 1
1 Stavropol State Medical Academy Department of Obstetrics and Gynecology
Изучены особенности изменений местного иммунитета у больных эндометриоидными кистами яичников (ЭКЯ) на фоне недифференцированной дисплазии соединительной ткани (НДСТ). На уровне перитонеального микроокружения у больных ЭКЯ развивается иммунологическая дисфункция, которая характеризуется увеличением активности макрофагов и снижением активности Т-лимфоцитов и естественных киллеров. Обозначенные изменения усугубляются у больных ЭКЯ в сочетании с НДСТ, на что указывает уменьшение в перитонеальной жидкости количества CD4-лимфоцитов, CD16-лимфоцитов и CD25-лимфоцитов. У пациенток с эндометриоидными кистами яичников в сочетании с НДСТ отмечается увеличение уровня провоспалительных цитокинов, обладающих проангиогенным действием: IL1β, TNFα, IL6, IL8. Кроме того, при ЭКЯ с сопутствующей НДСТ в нативной ПЖ наблюдается снижение уровня противоопухолевых цитокинов IL2 и IFNγ. Подобные изменения в цитокиновом составе перитонеальной жидкости, наряду со снижением количества иммунокомпетентных клеток, обладающих противоопухолевой цитотоксичностью, определяют увеличение проангиогенной и снижение противоопухолевой активности.
Peculiarities of changes in local immunity in patients with endometrioid ovarian cysts on the background of undifferentiated dysplasia of connective tissues. In the peritoneal microenvironment level, in patients with endometrioid ovarian cysts develop immunological dysfunction, which is characterized by increased activity of macrophages and decreased activity of T-lymphocytes and natural killer cells . Certain changes are exacerbated in patients with both endometrioid ovarian cysts and undifferentiated dysplasia of connective tissue, such as a decrease in the number of peritoneal fluid lymphocyte CD4-, CD16-, CD25- lymphocytes and B lymphocytes. In patients with endometrioid ovarian cysts combined with undifferentiated dysplasia of connective tissues, have increased levels of proinflammatory cytokines which promotes a proangiogenic effect: IL1β, TNFα, IL6, IL8. In addition, when endometrioid ovarian cysts are concomitant with undifferentiated dysplasia of connective tissues the level of antitumor cytokine IL2 and IFNγ are decreased. Similar changes in the cytokine composition of the peritoneal fluid, along with reduction of the number of immunocompetent cells with antitumor cytotoxicity determine the increase of proangiogenic and decrease of antitumor activity.
endometrioid ovarian cysts
undifferentiated connective tissue dysplasia
immunological dysfunction
cytokines
1. Adamian L. Endometriosis: A Guide for Physicians / L.V. Adamian, V.I. Kulakov, E.N. Andreev. M., 2006. 416.
2. Vozianov A.F. Cytokines. Biological and antitumor properties / A.F. Vozianov, A.K. Butenko, K.P. Zack. Kiev, 1998. 317.
3. Dolgih V.T. Fundamentals of Immunology. M., 2003. 227.
4. The study of cytokines and angiogenic potential of peritoneal fluid in patients with external genital endometriosis / D.I. Sokolov [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2005 Volume 140, no. 11. рр. 552–555.
5. Clemen A.V. Connective tissue dysplasia and pregnancy (Review) / A.V. Clemen, O.N. Tkachev, A.L. Vertkin // Therapeutic Archives. 2004. 11. T. рр. 80–83.
6. Clemen A.V. Undifferentiated connective tissue dysplasia. M., 2005. 136.
7. Features of cytokine production by immunocompetent cells of peritoneal fluid in women with external genital endometriosis / G.T. Dry [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2004 Volume 137, no. 6 рр. 646–649.
8. A variety of clinical symptoms of connective tissue dysplasia / V.I. Makolkin [et al.] // Ter. archive. 2004 T. 76, no. 11. 77–80.
9. Rebrov O. Statistical analysis of medical data. Application software package STATISTICA. M., 2002. 312.
10. Roit A. Immunology / A. Roit, J. Brostoff, D. Mail. M., 2000. 592.
11. Simbirtsev A.S. Cytokines a new system of regulation of immune function // Cytokines and Inflammation. 2002. Vol. 1, no. 1. рр. 9–17.
12. Smirnov V.S. Immunodeficiency / V.S. Smirnov, I.S. Freidlin. St. Petersburg., 2000. 568.
13. Iagoda A.V. Evaluation of External phenotypic traits to identify minor heart anomalies / A.V. Berry, N.N. Gladkih // Wedge. honey. 2004 Vol. 82, no. 7. рр. 30–33.
14. Blood leukocyte subsets are modulated in patients with endometriosis / D. Gagne [et al.] // Fertil. Steril. 2003. Vol. 80, no. 1. рр. 43–53.
15. Harada T. Role of cytokines in endometriosis / T. Harada, T. Iwabe, N. Terakawa // Fertil. Steril. 2001. Vol. 76, no. 1. рр. 1–10.
16. Iwabe T. Role of cytokines in endometriosis-associated infertility / T. Iwabe, N. Tekarawa // Gynecol. Obstet. Invest. 2002. Vol. 53, no. 1. рр. 19–25.
17. Pyeritz R.E. Small molecule for a large disease // N. Engl. J. Med. 2008. Vol. 358, no. 26. рр. 2829–2831.
18. Peritoneal and peripheral B-1-cell populations in patients with endometriosis / F. Chishima [et al.] // J. Obstet. Gynecol. Res. 2000. Vol. 26, no. 2. рр. 141–149.
19. The involvement of T-lymphocytes in the pathogenesis of endometriotic tissues overgrowth in women with endometriosis / K. Szyllo [et al.] // Mediators Inflamm. 2003. Vol. 12, no. 3. рр. 131-138.

Важная роль в возникновении и прогрессировании эндометриоза принадлежит иммунной системе [4, 7, 15, 16]. Согласно современным взглядам, противоопухолевый иммунитет представляет собой комплекс иммунных реакций, протекающих при тесном кооперативном взаимодействии между Т- и В-лимфоцитами, естественными киллерами (ЕК) и макрофагами, которое регулируется посредством выработки клетками иммунной системы медиаторов межклеточных взаимодействий – цитокинов [2, 3, 10, 12]. Цитокины образуют сложную и многообразную, но в то же время единую систему, обеспечивающую процессы межклеточной кооперации, роста и дифференцировки лимфоидных клеток, ангиогенеза и нейроиммунноэндокринных взаимодействий [2, 3, 10, 11].

Особый интерес представляет изучение особенностей иммунитета в местах локализации эндометриоидных очагов – в яичниках и перитонеальной жидкости [1, 14, 18, 19].

В то же время при возникновении и прогрессировании эндометриоза в ПЖ больных увеличивается количество макрофагов и снижается количество CD3, CD4 (Т-хелперов), CD16 (естественных киллеров) и CD25 (активированных Т-лимфоцитов) клеток. Увеличение активности перитонеальных иммунокомпетентных клеток сопровождается продукцией ими факторов, обладающих не только цитотоксическим действием на клетки опухоли, но и активизирующих процессы ангиогенеза, а также стимулирующих адгезию клеток эндометрия к мезотелию брюшины.

Подобные нарушения иммунитета имеются при недифференцированной дисплазии соединительной ткани (НДСТ), вследствие чего при сочетании данных патологий возможно прогрессирование процесса. В настоящее время имеется множество работ, свидетельствующих о роли НДСТ в развитии гинекологических заболеваний [5, 6, 8, 17]. Однако в доступной литературе нами не найдена информация об особенностях изменений иммунитета при сочетании ЭКЯ и НДСТ.

Цель исследования – выявить особенности изменений местного иммунитета у больных эндометриоидными кистами яичников на фоне НДСТ.

Материалы и методы исследования

В исследование включены 100 женщин в возрасте от 18 до 40 лет, которые были разделены на несколько групп:

I основную группу составили 35 больных ЭКЯ, у которых было выявлено более 6-ти внешних фенотипических признаков НДСТ;

II группу сравнения составили 35 больных ЭКЯ с количеством признаков НДСТ 6 и менее.

В контрольную группу вошли 30 женщин репродуктивного возраста без НДСТ и сопутствующей гинекологической патологии, с двухфазным менструальным циклом, поступивших для выполнения хирургической стерилизации.

Всем пациенткам для исследования внешнего фенотипа применяли модифицированную фенотипическую карту, включающую 63 показателя [13]. Всем пациенткам проведено клинико-лабораторное и инструментальное исследование, лечебно-диагностическая лапароскопия. Диагноз ЭКЯ подтвержден гистологически.

Объем иммунологического исследования включал изучение относительного и абсолютного количества основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток в ПЖ (лимфоциты, нейтрофилы, мононуклеарные фагоциты, CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25 – лимфоциты), а также изучение уровня IL1b, IL2, IL4, IL6, IL8, TNFa, IFNg в нативной перитонеальной жидкости (ПЖ) пациенток исследуемых групп.

Определение состава субпопуляций МНК в ПЖ выполняли методом проточной цитометрии. На первом этапе проводили обработку клеток. Для этого к восьми образцам ПЖ объемом по 100 мкл каждый добавляли растворы антител, конъюгированных с флуоресциинизотиоционатом (FITC) и фикоэритрином (PE) («Caltag Laboratories», США) на проточном цитометре Bio Rad («Brute-HS», США).

Концентрацию IL1b, IL2, IL4, IL6, IL8, TNFa, IFNg в ПЖ определяли методом твердофазового иммуноферментного анализа (ИФА) на планшетном фотометре «Labsystems iEMS Reader MF» (Финляндия) с использованием наборов «ВекторБест» (Россия) согласно прилагаемым к наборам методикам.

Статистическая обработка полученных данных проводилась на компьютере PENTIUM IV с использованием программы «Statistica 6.0» [9]. В соответствии с целями и задачами исследования, а также с учетом специфики анализируемых переменных нами выполнялся расчет элементарных статистик (средние значения (M), ошибки средних (m), расчет долей (%), стандартной ошибки доли (N)); сравнение качественных параметров в исследуемых группах с помощью непараметрических методов χ2, критерия Фишера с поправкой Йейтса; сравнение количественных показателей с помощью непараметрического критерия Манна – Утни. Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали общепринятую в медицине величину р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

При анализе данных было установлено, что в ПЖ больных основной группы, по сравнению с пациентками без НДСТ и здоровыми женщинами, наблюдалось достоверно большее относительное (62,35 ± 1,59, 56,58 ± 1,43 и 37,82 ± 2,25 % соответственно) и абсолютное (1,62 ± 0,13•109/л, 1,54 ± 1,43•109/л и 0,61 ± 0,10•109/л соответственно) количество макрофагов, в то время как процентное содержание лимфоцитов (20,95 ± 1,39, 24,62 ± 1,10 и 43,40 ± 1,92 % соответственно) снижалось. Необходимо отметить, что снижение относительного числа лимфоцитов в ПЖ больных ЭКЯ как основной группы, так и группы сравнения не сопровождалось уменьшением их абсолютного количества, что связано с увеличением общей «клеточности» ПЖ при данном заболевании (табл. 1).

При изучении субпопуляционного состава МНК ПЖ было установлено достоверное снижение абсолютного количества CD4-лимфоцитов (0,22 ± 0,02•109/л, 0,28 ± 0,02•109/л и 0,37 ± 0,02•109/л соответственно), а также процентного (12,41 ± 0,95, 15,69 ± 0,91 и 24,00 ± 2,00 %, соответственно) и абсолютного (0,06 ± 0,01•109/л, 0,09 ± 0,01•109/л и 0,17 ± 0,01•109/л соответственно) количества CD16 и процентного (17,92 ± 1,34, 22,55 ± 1,43 и 32,10 ± 3,70 % соответственно) и абсолютного (0,10 ± 0,01•109/л, 0,15 ± 0,01•109/л и 0,22 ± 0,03•109/л соответственно) количества CD25-лимфоцитов в ПЖ больных ЭКЯ с НДСТ, чем у пациенток группы сравнения и здоровых женщин (табл. 2).

Относительное и абсолютное количество CD8- и CD19-лимфоцитов в ПЖ больных ЭКЯ не претерпевало существенных изменений вне зависимости от наличия НДСТ (табл. 2).

В ПЖ больных ЭКЯ с НДСТ по сравнению с больными группы сравнения и здоровыми женщинами, увеличивается уровень IL1β (519,40 ± 16,96 пкг/мл, 475,20 ± 13,30 пкг/мл и 131,60 ± 7,18 пкг/мл соответственно), TNFα (58,29 ± 4,38 пкг/мл, 46,44 ± 3,61 пкг/мл и 8,09 ± 1,32 пкг/мл соответственно), IL6 (98,09 ± 6,07 пкг/мл, 80,33 ± 6,06 пкг/мл и 44,52 ± 2,75 пкг/мл соответственно) и IL8 (274,30 ± 11,82 пкг/мл, 227,20 ± 19,88 пкг/мл и 23,30 ± 2,70 пкг/мл соответственно), снижается уровень IL2 (18,57 ± 1,16 пкг/мл, 22,28 ± 1,26 пкг/мл и 29,70 ± 1,60 пкг/мл соответственно) и IFNγ (50,18 ± 4,43 пкг/мл, 68,60 ± 5,41 пкг/мл и 121,30 ± 10,80 пкг/мл, соответственно), а уровень IL4 не изменяется (табл. 3).

Таблица 1

Популяционный состав иммунокомпетентных клеток ПЖ больных ЭКЯ в зависимости от наличия НДСТ

Показатель

Здоровые женщины (n = 30)

Больные ЭКЯ

Есть НДСТ

(n = 35)

Нет НДСТ

(n = 35)

Номер группы

1

2

3

M ± m*

Лейкоциты, •109

1,60 ± 0,12

2,55 ± 0,15

2,60 ± 0,16

Достоверность отличий**

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,820

 

Нейтрофилы, %

14,60 ± 0,75

13,24 ± 0,36

13,42 ± 0,26

Достоверность отличий

P1-2 = 0,107

P1-3 = 0,142

P2-3 = 0,686

 

Нейтрофилы, •109

0,23 ± 0,01

0,29 ± 0,03

0,30 ± 0,04

Достоверность отличий

P1-2 = 0,062

P1-3 = 0,094

P2-3 = 0,842

 

Макрофаги, %

37,82 ± 2,25

62,35 ± 1,59

56,58 ± 1,43

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,009

 

Макрофаги, •109

0,61 ± 0,10

1,62 ± 0,13

1,54 ± 0,11

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,001

 

Лимфоциты, %

43,40 ± 1,92

20,95 ± 1,39

24,62 ± 1,10

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,042

 

Лимфоциты, •109

0,69 ± 0,12

0,54 ± 0,04

0,63 ± 0,05

Достоверность отличий

P1-2 = 0,240

P1-3 = 0,646

P2-3 = 0,164

 

Примечания:

* M – среднее значение; m – среднее отклонение;

** – различия между группами достоверны при p < 0,05, критерий Манна – Уитни.

Таблица 2

Субпопуляционный состав МНК ПЖ больных ЭКЯ в зависимости от наличия НДСТ

Показатель

Здоровые женщины

(n = 30)

Больные ЭКЯ

Есть НДСТ

(n = 35)

Нет НДСТ

(n = 35)

1

2

3

4

Номер группы

1

2

3

M ± m*

CD3, %

72,50 ± 5,50

57,03 ± 1,38

57,16 ± 1,43

Достоверность отличий **

P1-2 = 0,008

P1-3 = 0,009

P2-3 = 0,948

 

CD3, •109

0,50 ± 0,07

0,31 ± 0,02

0,35 ± 0,02

Достоверность отличий

P1-2 = 0,011

P1-3 = 0,043

P2-3 = 0,162

 

1

2

3

4

CD4, %

53,00 ± 1,00

41,34 ± 1,00

42,12 ± 1,11

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,603

 

CD4, •109

0,37 ± 0,02

0,22 ± 0,02

0,28 ± 0,02

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,038

 

CD8, %

25,50 ± 1,50

26,84 ± 1,19

27,79 ± 1,19

Достоверность отличий

P1-2 = 0,486

P1-3 = 0,236

P2-3 = 0,574

 

CD8, •109

0,18 ± 0,02

0,14 ± 0,01

0,18 ± 0,01

Достоверность отличий

P1-2 = 0,078

P1-3 = 1,000

P2-3 = 0,078

 

CD16, %

24,00 ± 2,00

12,41 ± 0,95

15,69 ± 0,91

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,015

 

CD16, •109

0,17 ± 0,01

0,06 ± 0,01

0,09 ± 0,01

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,038

 

CD19, %

23,00 ± 2,00

21,09 ± 0,86

20,25 ± 0,78

Достоверность отличий

P1-2 = 0,383

P1-3 = 0,205

P2-3 = 0,472

 

CD19, •109

0,16 ± 0,04

0,12 ± 0,01

0,13 ± 0,01

Достоверность отличий

P1-2 = 0,335

P1-3 = 0,469

P2-3 = 0,482

 

CD25, %

32,10 ± 3,70

17,92 ± 1,34

22,55 ± 1,43

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,019

P2-3 = 0,021

 

CD25, •109

0,22 ± 0,03

0,10 ± 0,01

0,15 ± 0,01

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,030

P2-3 = 0,001

 

Примечания:

* M – среднее значение, m – среднее отклонение;

** – различия между группами достоверны при p < 0,05, критерий Манна – Уитни.

Таблица 3

Уровень цитокинов в ПЖ больных ЭКЯ в зависимости от наличия НДСТ

Показатель

Здоровые женщины

(n = 30)

Больные ЭКЯ

Есть НДСТ

(n = 35)

Нет НДСТ

(n = 35)

1

2

3

4

Номер группы

1

2

3

M ± m*

IL1β, пкг/мл

131,60 ± 7,18

519,40 ± 16,96

475,20 ± 13,30

Достоверность отличий**

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,043

 

TNFα, пкг/мл

8,09 ± 1,32

58,29 ± 4,38

46,44 ± 3,61

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,041

 

IFNγ, пкг/мл

121,30 ± 10,80

50,18 ± 4,43

68,60 ± 5,41

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,010

 

IL2, пкг/мл

29,70 ± 1,60

18,57 ± 1,16

22,28 ± 1,26

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,034

 

1

2

3

4

IL4, пкг/мл

60,10 ± 5,10

55,94 ± 3,79

65,90 ± 4,15

Достоверность отличий

P1-2 = 0,515

P1-3 = 0,381

P2-3 = 0,081

 

IL6, пкг/мл

44,52 ± 2,75

98,09 ± 6,07

80,33 ± 6,06

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,042

 

IL8, пкг/мл

23,30 ± 2,70

274,30 ± 11,82

227,20 ± 19,88

Достоверность отличий

P1-2 = 0,001

P1-3 = 0,001

P2-3 = 0,046

 

Примечания:

* M – среднее значение, m – среднее отклонение;

** – различия между группами достоверны при p < 0,05, критерий Манна – Уитни.

Заключение

Резюмируя полученные данные, можно утверждать, что на уровне перитонеального микроокружения у больных ЭКЯ развивается иммунологическая дисфункция, которая характеризуется увеличением активности макрофагов и снижением активности Т-лимфоцитов и ЕК. Обозначенные изменения усугубляются у больных ЭКЯ в сочетании с НДСТ, на что указывает уменьшение в ПЖ количества CD4-лимфоцитов в 1,3 раза по сравнению с пациентками без НДСТ и в 1,7 раза по сравнению со здоровыми женщинами, CD16-лимфоцитов – в 1,5 и в 2,8 раза соответственно, и CD25-лимфоцитов – в 1,5 и в 2,2 раза соответственно, а также увеличение количества макрофагов в 2,7 раза по сравнению со здоровыми женщинами.

Изменение состава МНК ПЖ больных ЭКЯ при НДСТ, по сравнению с больными ЭКЯ без НДСТ и здоровыми женщинами, закономерно сопровождается увеличением уровня провоспалительных цитокинов, обладающих проангиогенным действием: содержание IL1β увеличивается в 1,1 и 3,9 раза соответственно, TNFα – в 1,3 и 7,25 раз соответственно, IL6 – в 1,2 и 2,2 раз соответственно, IL8 – в 1,2 и 11,7 раз соответственно. Кроме того, при ЭКЯ в сочетании с НДСТ в нативной ПЖ наблюдается снижение уровня противоопухолевых цитокинов IL2 в 1,2 раза и IFNγ в 1,36 раз по сравнению с пациентками без НДСТ. Подобные изменения в цитокиновом составе ПЖ, наряду со снижением количества иммунокомпетентных клеток, обладающих противоопухолевой цитотоксичностью, определяют увеличение проангиогенной и снижение противоопухолевой активности, что может являться одной из предпосылок для увеличения частоты рецидивов ЭКЯ при наличии у пациенток сопутствующей НДСТ. Полученные данные требуют дальнейшего изучения.

Рецензенты:

Рыжков В.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии ФПДО, Ставропольский государственный медицинский университет, г. Ставрополь;

Чарышкин А.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой факультетской хирургии, ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», г. Ульяновск.

Работа поступила в редакцию 04.09.2014.