Окислительный стресс развивается при действии разнообразных факторов, включая производственные, природные, климатические условия [2, 4]. Многие годы главное внимание было уделено исследованию процессов липопероксидации, так как радикал гидроксила способен проникать в гидрофобный липидный слой и вступать во взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами, в результате этого развивается цепная реакция перекисного окисления липидов, являющаяся важнейшей в процессах повреждения биологических мембран. Широкий спектр методов исследования пероксидации липидов способствовал накоплению многочисленных сведений о повышении уровня продуктов этого процесса при различных воздействиях, многих заболеваниях и интоксикациях [9].
Однако в последние годы все больше внимания уделяется окислительной деструкции белков. Проведено большое количество исследований, подтверждающих, что при ряде патологических состояний именно белки, а не липиды и нуклеиновые кислоты являются одним из ранних маркеров окислительного стресса [12]. Одним из проявлений окислительной деструкции белков является повышение карбонильных производных белков. В ранних работах роль окислительной модификации белков (ОМБ) рассматривалась при физиологических состояниях в тканях, с которыми связаны процессы старения организма. В последующих работах установлено, что карбонильные производные белков при окислительных повреждениях в тканях проявляются раньше и они более стабильны по сравнению с продуктами пероксидации липидов [14].
В предыдущих исследованиях установлено, что содержание некоторых продуктов перекисного окисления липидов изменяется не только в крови, но и в молоке коров при послеродовом эндометрите [3]. Содержание продуктов пероксидации липидов и антиокислительные свойства отличаются также в молоке крупного рогатого скота в разных природно-климатических зонах Омской области [2, 6].
Учитывая изложенное, целью настоящей работы является сравнение параметров интенсивности перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков коровьего молока для оценки интенсивности свободнорадикальных процессов крупного рогатого скота хозяйств, расположенных на различных расстояниях от промышленного центра.
Материалы и методы исследования
Для исследования использовали сырое, нормализованное по массовой доле жира до 2,5 %, натуральное молоко, полученное зимой от коров в пригородной зоне – 5–15 километров от города Омска и на удалении на 100–150 километров к северу (лесная зона) и югу (степная зона) от промышленного центра.
Содержание первичных, вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли с помощью экстракционно-спектрометрического метода с раздельной регистрацией липопероксидов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта молока, полученного с помощью гептан-изопропанольной смеси (1:1 по объёму) [1]. Спектрофотометрию каждой фазы липидного экстракта проводили при трех длинах волн – 220, 232, 278 нм в кварцевых кюветах толщиной 1 см против соответствующего контроля, что позволило установить уровень первичных продуктов (диеновых конъюгатов), вторичных продуктов (кетодиенов и сопряженных триенов) липопероксидации. В гептановую фазу экстрагируются нейтральные липиды, а в изопропанольную фазу переходят фосфолипиды, которые являются важнейшими субстратами пероксидации.
Относительное содержание конечных продуктов липопероксидации (шиффовых оснований) определяли по величине оптической плотности гептановых и изопропанольных фаз липидных экстрактов при длине волны 400 нм [8]. Содержание продуктов свободнорадикального окисления липидов выражали в единицах окислительного индекса (е.о.и.): Е232/Е220 – первичные, Е278/Е220 – вторичные, Е400/Е220 – конечные.
Уровень спонтанной и металлкатализируемой ОМБ определяли методом, основанным на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидрозином и образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрировали фотометрически при следующих длинах волн: 356, 370, 430 и 530 нм [5]. Количество доступных сульфгидрильных групп молока – оценивали спектрофотометрически с помощью 5,5/-дитиобис-2-нитробензойной кислоты с образованием окрашенного дисульфида [11].
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Статистическая значимость межгрупповых различий оценивалась по критерию Манна – Уитни (U). Проверка статистических гипотез проводилась при критическом уровне значимости р = 0,05. Результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартиля – Ме (Q1; Q3).
Результаты исследования и их обсуждение
Содержание первичных продуктов липопероксидации (диеновых конъюгатов), как в гептановой, так и в изопропанольной фазе липидного экстракта молока коров существенно не отличалось в различных регионах Омской области. Не обнаружено существенных различий в содержании вторичных продуктов пероксидации липидов (кетодиенов и сопряженных триенов) в гептановой фазе молока различных регионов. Однако содержание кетодиенов и сопряженных триенов в изопропанольной фазе липидного экстракта молока, полученного в пригородной зоне города, на 24 % (р = 0,037) выше, чем в северных районах Омской области (табл. 1).
В отличие от показателей процессов пероксидации липидов уровень маркеров ОМБ отличается в различных районах Омской области. Так, содержание алифатических кетон-динитрофенилгидразонов в пригороде Омска значительно ниже в сравнении с пробами молока, полученного в хозяйствах южных и северных районов. (табл. 2). Индуцированная железом ОМБ проявлялась в повышении уровня алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов нейтрального характера в пригороде Омска на 41 % (р = 0,007) в отличие от молока, полученного в северной части Омской области. В пригороде Омска выявлено значительное повышение кетон-динитрофенилгидразонов на 48 % (р = 0,022) и 47 % (р = 0,001), альдегид-динитрофенилгидразонов на 29 % (р = 0,043) и 36 % (р = 0,0004) и кетон-динитрофенилгидразонов основного характера на 33 % (р = 0,049) и 56 % (р = 0,0033) относительно южных и северных районов соответственно. Статистически значимых различий между показателями окислительной деструкции белков между северными и южными районами области не обнаружено.
Таблица 1
Продукты липопероксидации в гептановой и изопропанольной фазе липидного экстракта молока, Ме (Q1; Q3)
|
Показатель Регионы исследования |
Гептановая фаза |
Изопропанольная фаза |
||
|
Диеновые конъюгаты, е.о.и. |
Кетодиены и сопряженные триены, е.о.и. |
Диеновые конъюгаты, е.о.и. |
Кетодиены и сопряженные триены, е.о.и. |
|
|
Северные районы n = 10 |
0,938 (0,882; 0,950) |
0,080 (0,069; 0,094) |
0,769 (0,588;0,771) |
0,373 (0,343; 0,500) |
|
Южные районы n = 12 |
1,000 (1,059; 1,000) |
0,095 (0,081; 0,103) |
0,539 (0,470;0,720) |
0,447 (0,415; 0,601) |
|
Пригород Омска n = 10 |
1,000 (0,944; 1,125) |
0,073 (0,063; 0,094) |
0,756 (0,667; 0,811) |
0,490* (0,467; 0,568) |
Примечание * – статистически значимые отличия от Северных районов, Р < 0,05.
Таблица 2
Содержание карбонильных производных белков, Ме (Q1; Q3)
|
Регионы исследования |
Карбонильные производные белков (е.о.п. на 1 мг белка) |
||||
|
370 нм |
356 нм (Fe2+/H2O2) |
370 нм (Fe2+/H2O2) |
430 нм (Fe2+/H2O2) |
530 нм (Fe2+/H2O2) |
|
|
Северные районы n = 10 |
0,033 (0,030; 0,048) |
0,134 (0,122; 0,139) |
0,142 (0,128; 0,143) |
0,074 (0,059; 0,077) |
0,008 (0,004; 0,009) |
|
Южные районы n = 12 |
0,070 (0,038; 0,085) |
0,133 (0,082; 0,164) |
0,137 (0,085; 0,168) |
0,081 (0,052; 0,104) |
0,012 (0,005; 0,021) |
|
Пригород Омска n = 10 |
0,004* х (0,000; 0,010) |
0,229* (0,158; 0,264) |
0,266* х (0,164; 0,277) |
0,115** х (0,088; 0,157) |
0,018* х (0,008; 0,032) |
Примечание. * – статистически значимые отличия от северных районов, Р < 0,05, ** – статистически значимые отличия от северных районов, Р < 0,001, х – статистически значимые отличия от южных районов, Р < 0,05.
Рис. 1. Содержание доступных сульфгидрильных групп в молоке разных климато-географических зон Омской области (ммоль/л)
Различия в окислительной модификации белков проявляются и в содержании восстановленных сульфгидрильных групп. В молоке, полученном в пригороде Омска, обнаружено снижение уровня доступных тиоловых групп белков молока на 29 и 26 % относительно образцов, полученных в северных и южных районах соответственно. Аналогично уменьшается содержание сульфгидрильных групп цельного молока на 11 % и 15 % относительно вышеуказанных районов (рис. 1, 2). При этом не выявлено существенных различий содержания доступных SH-групп в сыворотке молока, а также свободных тиоловых групп безбелкового фильтрата.
Рис. 2. Содержание доступных сульфгидрильных групп в белках молока разных климато-географических зон Омской области (ммоль/л)
Полученные результаты свидетельствуют о том, что значительных отличий в интенсивности пероксидации липидов молока в разных климато-географических зонах Омской области не обнаружено, что подтверждается ранее полученными данными об отсутствии различий антиокислительной активности молока северных и южных зон Омской области [10]. Только уровень кетодиенов и сопряженных триенов существенно выше в молоке коров пригородной зоны в изопропанольной фазе экстракта, содержащей преимущественно фосфолипиды, наиболее легко подвергающиеся пероксидации [11]. При отсутствии существенных изменений большинства показателей пероксидации липидов значительные изменения установлены среди маркёров окислительной модификации белков, что подтверждает указания [14] о большей чувствительности уровня карбонилирования белков в сравнении с показателями СРО липидов. Способность белков подвергаться окислительной модификации подтверждается данными о том, что α-казеин (αs1 и αs2-казеин) и β-казеин сильнее подвержены окислительной деструкции за счет более активного карбонилирования триптофана, метионина и гистидина, входящих в состав данных фракций белков по отношению к сывороточным белкам молока [13]. Вероятно, этим фактом можно объяснить отсутствие различий в содержании сульфгидрильных групп сыворотки молока и, в противоположность этому, значительные изменения их уровня в цельном молоке и особенно в содержании белковых тиоловых групп.
Отсутствие различий между показателями свободнорадикального окисления липидов и окислительной модификации белков северных районов (лесная зона) и южных районов (степная зона) в зимний период может быть объяснено отсутствием различий корма в этот период. В то же время значительные различия показателей СРО молока хозяйств пригорода промышленного центра могут быть обусловлены антропогенными факторами, нарушающими равновесие экосистемы [7].
Заключение
Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о большей чувствительности показателей окислительной модификации белков в сравнении с маркёрами пероксидации липидов, что позволяет их использовать для выяснения воздействия на организм различных факторов внешней среды.
Повышение уровня металлоиндуцированой ОМБ и значительное снижение тиоловых групп белков молока пригорода промышленного центра указывает на повышенную способность белков молока подвергаться окислительной модификации под влиянием экологических факторов. Определение уровня ОМБ может быть использовано как компонент экофизиологического скрининга.
Рецензенты:
Григорьев А.И., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой экологии и природопользования, ФГБОУ ВПО «Омский государственный педагогический университет» Минобрнауки РФ, г. Омск;
Степанова И.П., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой химии, ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, г. Омск.
Работа поступила в редакцию 23.09.2014.