Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Воздействие неблагоприятных экологических факторов на организм человека зачастую сопровождается нарушением согласованного функционирования внутриклеточных молекулярных процессов, что является фоном для развития разнообразной хронической патологии [5]. Экологические факторы существенным образом влияют на клеточные взаимодействия в иммунной системе, нарушая работу как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа [2, 5].

Широкое применение в повседневной деятельности человека средств бытовой и пищевой химии, а также использование химии в сельском хозяйстве является мощным источником поступления во внутреннюю среду организма ксенобиотиков, способных оказывать прямое иммунодепрессивное действие путем нарушения межклеточной кооперации Т-хелперов [2, 5, 8].

В условиях воздействия на организм неблагоприятных факторов внешней среды и развития патологических изменений, сопровождающихся снижением механизмов естественной защиты организма, особую значимость приобретает задача повышения неспецифической резистентности клеток. Кроме того, выздоровление требует восстановления нормального уровня реактивности внутриклеточных молекулярных систем, а также активации процессов саногенеза [5, 7, 8].

Особую значимость имеют возможности коррекции патофизиологических нарушений при внебольничной пневмонии (ВП).

Результаты биофизических исследований свидетельствуют о том, что модификация физических параметров водной среды низкоинтенсивным электромагнитным излучением (ЭМИ) сопровождается заметным биологическим эффектом, реализующимся на уровне трансдукции рецепторных сигналов, транскрипции и др. процессов [1, 6].

Цель исследования – изучение последствий кратковременного облучения цельной крови больных ВП ЭМИ.

Материалы и методы исследования

Обследовано 30 пациентов мужского пола с ВП нетяжелого течения в стадии реконвалесценции (15–17 сутки) в возрасте 20–35 лет. Материалом для исследования служила венозная кровь. Путем разделения пробы крови на четыре части, формировали четыре подгруппы. Первая (1) подгруппа включала необлученные образцы крови (n = 30), 2-я – образцы, подвергнутые СВЧ-облучению при мощности 0,05 мкВт/см2, 3-я – 0,1 мкВт/см2, 4-я – 0,15 мкВт/см2. Контрольная группа (К) включала необлученные образцы цельной крови здоровых добровольцев.

Исследование проводили с использованием наборов «Цитокин-Стимул-Бест» (ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск). При этом 1 мл цельной крови вносили во флакон, содержащий 4 мл среды DMEM, с последующим облучением в течение 45 минут аппаратом микроволновой терапии «Акватон-02» (ООО «ТЕЛЕМАК», г. Саратов) на частоте 1000 ± 0,01 МГц с плотностью потока мощности (ППМ) излучения 0,05–0,15 мкВт/см2. После облучения флаконы помещались на 24 часа в термостат (t – 37 °С) с последующим выделением на градиенте фиколл-верографин (ρ = 1,077) мононуклеаров и забором клеточного супернатанта. Оценка функционального состояния клеток проводилась методом ИФА и включала определение в клеточном супернатанте концентрации интерлейкинов (ИЛ): ИЛ-4, ИЛ-12, ИЛ-22, интерферона (ИНФ) ИНФ-γ. В лизате мононуклеаров определяли концентрацию факторов без учета характера их фосфорилирования: JNK1/2, MAPK38, ERK1/2, JAK2 и STAT6. Иммуноферментный анализ проводился на анализаторе Personal LAB (Adaltis Italia S.p.A., Италия) с использованием реактивов CUSABIO BIOTECH (Китай).

Статистическую обработку проводили в программе Statistica 7,0. Статистическую значимость (р) межгрупповых различий оценивали с помощью критерия Вилкоксона [3].

Результаты исследования и их обсуждение

Внутриклеточная концентрация протеинкиназ в группах исследования представлена в табл. 1.

Таблица 1

Влияние низкоинтенсивного СВЧ-облучения культуры клеток цельной крови на внутриклеточное содержание SAPK/MAPK протеинкиназ (нг/мл)

Развитие воспаления характеризуется повышением внутриклеточной концентрации киназ JNK, ERK и MAPK в лизате мононуклеаров в сравнении со здоровыми лицами в 1,28 (р = 0,11), 2,0 (р = 0,024) и 2,15 (р = 0,0031) раз соответственно. Таким образом, у обследованных пациентов из числа практически здоровых лиц соотношение внутриклеточных концентраций протеинкиназ ERK/JNK составляло 0,68 ± 0,012, ERK/MAPK38 и JNK/MAPK38 – 8,6 ± 0,09 и 5,8 ± 0,1.

Результаты исследования свидетельствуют об увеличении средних значений внутриклеточной концентрации MAPK38 на 12,1 % (р = 0,092), 29,3 % (р = 0,0015) и 48,3 % (р = 0,00001) под влиянием соответствующего увеличения ППМ излучения от 0,05 до 0,15 мкВт/см2. В указанном диапазоне мощностей облучения динамика средних значений внутриклеточной концентрации ERK1/2 составила 1,9 % (р = 0,86), 4,6 % (р = 0,74) и 6,0 % (р = 0,32), JNK1/2 – 3,4 % (p = 0,84), 8,4 % (p = 0,37) и 13,3 % (p = 0,057) соответственно.

Проведенный анализ результатов облучения цельной крови больных ВП свидетельствует, что соотношение внутриклеточной концентрации киназы ERK/JNK составляет 0,4 ± 0,01, соотношение ERK/MAPK и JNK/MAPK – 8,0 ± 0,03 и 3,5 ± 0,018 соответственно. Под влиянием облучения отмечалось увеличение соотношения ERK/JNK на 6,2 % (р = 0,38) и снижение на 23,6 % (р = 0,044) и 28,5 % (р = 0,041) ERK/MAPK и JNK/MAPK.

Таким образом, проведенный анализ показал, что под влиянием облучения «классический» MAPK сигнальный путь трансдукции, терминальной киназой которого является ERK, наименее подвержен СВЧ-воздействию.

Внутриклеточная концентрация общих форм JAK/STAT киназ в агранулоцитах больных ВП в группах исследования представлена в табл. 2.

Таблица 2

Влияние низкоинтенсивного СВЧ-облучения культуры клеток цельной крови на внутриклеточное содержание исследуемых факторов (нг/мл)

Результаты исследования указывают на увеличение у больных ВП, в сравнении со здоровыми лицами, внутриклеточной концентрации белков JAK2 и STAT6 в 2,2 (р = 0,013) и 4,6 (р = 0,007) раза соответственно. На этом фоне отмечено снижение концентрации фактора транскрипции NF-kB на 7,9 % (р = 0,11).

Облучение культуры клеток при ППМ 0,05 мкВт/см2 сопровождалось ростом внутриклеточной концентрации протеинкиназы JAK2 на 2,2 % (р = 0,23). При дальнейшем повышении мощности воздействия концентрация указанного фактора повышалась на 4,6 (р = 0,09) и 7,2 % (р = 0,04). На этом фоне отмечалась отрицательная динамика концентрации сигнального белка-трансдуктора и активатора транскрипции STAT6, проявлявшаяся уменьшением его внутриклеточной концентрации на 1,6 % (р = 0,81), 3,5 % (р = 0,63) и 5,6 % (р = 0,18). В то же время внутриклеточная концентрация фактора транскрипции NF-kB под влиянием облучения увеличивалась на 1,98 (р = 0,71), 4,11 (р = 0,29) и 6,62 % (р = 0,07) соответственно.

Таким образом, однократное СВЧ-облучение оказывает значимое влияние на состояние JAK/STAT и MAPK сигнальных путей, определяющих реактивность клетки на различные внешние воздействия, включая чувствительность к молекулам межклеточных взаимодействий. Влияние облучения на продукцию исследуемых цитокинов представлено в табл. 3.

Таблица 3

Концентрация цитокинов в исследуемых группах (пг/мл)

Проведенный анализ показал, что продукция цитокинов у реконвалесцентов ВП в сравнении со здоровыми лицами характеризуется повышением уровня ИЛ-12 в 2,64 раза (р = 0,011), ИЛ-4 в 1,77 раза (р = 0,03), ИЛ-22 на 29,0 % (р = 0,046) на фоне снижения продукции ИНФ-γ на 15,9 % (р = 0,055). Соотношение ИЛ-4/ИНФ-γ, характеризующее баланс клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа, остается повышенным у реконвалесцентов в сравнении со здоровыми лицами в 2,1 раза (р = 0,018), что является следствием высокой активности гуморального иммунного ответа у обследованных.

Влияние облучения при используемых режимах воздействия на продукцию ИЛ-12, являющегося активатором цитотоксических клеток, характеризовалось увеличением последней на 6,1 (р = 0,44), 12,8 (р = 0,21) и 18,9 % (р = 0,047). Продукция ИНФ-γ клетками цельной крови в этих же условиях возрастала на 3,6 (р = 0,74), 7,1 (р = 0,21) и 10,4 % (р = 0,04). На этом фоне рост концентрации ИЛ-4 в культуре составил 5,6 (р = 0,88), 5,6 (р = 0,18) и 5,1 % (р = 0,22). Уровень ИЛ-22, продуцируемого активированными дендритными клетками и Т-лимфоцитами, обеспечивающего сопряжение врожденного и приобретенного иммунного ответа, под влиянием облучения возрастал на 8,0 (р = 0,049), 16,0 (р = 0,018) и 23,0 % (р = 0,001).

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют об усилении под влиянием СВЧ-облучения активности клеточного звена иммунного ответа, в частности реализующегося с участием Т-хелперов 1-го типа.

Анализ состояния молекулярных механизмов регуляции метаболических функций мононуклеаров цельной крови реконвалесцентов ВП свидетельствует о сохранении в фазу реконвалесценции ряда патологических изменений. Так, результаты исследования указывают на сохранение у них высокой активности MAPK сигнальных путей, в особенности реализующихся посредством ERK-киназ, на фоне нормализации уровня NF-κB. Таким образом, реконвалесценция ВП сопровождается сохранением в агранулоцитах активации программ пролиферации и дифференцировки, что связано, с одной стороны, с элиминацией возбудителя и завершением острой фазы воспаления, а с другой, с незавершенностью процессов репарации и формирования адаптивного иммунитета [4, 9, 10]. Высокая внутриклеточная концентрация фактора транскрипции STAT6 и продукция ИЛ-4, очевидно, является условием сохранения баланса иммунного ответа в направлении Тh2-типа [4, 10].

Исследование продукции цитокинов под влиянием облучения указывает на стимуляцию клеточного иммунного ответа под влиянием низкоинтенсивного СВЧ-излучения, сопровождающуюся увеличением концентрации в супернатанте ИЛ-12. Проводимое воздействие способствует повышению продукции ИНФ-γ, концентрация которого у реконвалесцентов находится ниже соответствующих значений контрольной группы и свидетельствует об угнетении клеточного звена иммунитета у больных ВП. При этом биологический эффект СВЧ-облучения в отношении ИЛ-12 и ИНФ-γ пропорционален мощности воздействия, в отличие от продукции ИЛ-4. Положительная динамика концентрации ИЛ-22 под влиянием облучения также может рассматриваться как адаптивная реакция, направленная на усиление взаимосвязей местной неспецифической защиты и специфического иммунного ответа [4, 11].

Влияние СВЧ-излучения на фактор транскрипции STAT6, обеспечивающий поляризацию «наивных» Т-хелперов в Th2-типа, проявляющееся понижением его внутриклеточной концентрации, указывает на угнетение молекулярных механизмов формирования иммунного ответа в направлении Th2-типа, что можно считать проявлением адаптивного эффекта облучения, учитывая исходно высокую его внутриклеточную концентрацию [4].

Проведенный анализ также показал, что при максимальной мощности облучения имеет место нормализация внутриклеточной концентрации JAK2-киназы и фактора транскрипции NF-κB. Указанные изменения свидетельствуют о приближении клеточной реактивности у реконвалесцентов к ее уровню у здоровых лиц.

Анализ результатов исследования свидетельствует об активации под влиянием облучения MAPK сигнального пути. При этом в наибольшей степени облучение способствует повышению активности MAPK38, принимающей участие в формировании ответа на цитокины и развитии воспаления [4, 9]. Под влиянием облучения также наблюдается повышение продукции клетками цельной крови ИЛ-23 и ИЛ-12, активирующих и сопрягающих эффекторные механизмы врожденного и адаптивного иммунного ответа [4].

Таким образом, полученные результаты указывают, что низкоинтенсивное СВЧ-излучение на частотах резонансной прозрачности водных сред оказывает выраженный регуляторный эффект в отношении функциональной активности клеток иммунной системы у больных ВП.

Рецензенты:

Киреев С.С., д.м.н., профессор, вице-президент Тульского регионального отделения межрегиональной общественной организации «Академия медико-технических наук», г. Тула;

Хрупачев А.Г., д.т.н., лауреат государственной премии РФ, лауреат премии правительства РФ в области науки и техники, академик АМТН, г. Тула.

Работа поступила в редакцию 02.10.2014.