Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,441

SINGLE AMINO ACID SUBSTITUTIONS IN HAEMAGGLUTININ MOLECULE OF LIVE ATTENUATED INFLUENZA VACCINE STRAINS GENERATED IN DIFFERENT SUBSTRATES, AND THEIR INFLUENCE ON IMMUNOGENIСITY (IN VIVO EXPERIMENTS)

Fedorova E.A. 1 Kiseleva I.V. 1 Isakova-Sivak I.N. 1 Dubrovina I.A. 1 Rudenko L.G. 1
1 Institute of Experimental Medicine
Проведен анализ гетерогенности аминокислотного состава гемагглютинина (НА) в природной популяции штамма вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1). Проанализирован состав аминокислотных замен в гемагглютинине холодоадаптированных реассортантов, полученных на его основе в развивающихся куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK. Обнаружены вариабельные аминокислоты в позициях 78, 190, 225 в НА1 и 106 в НА2 (Н3-нумерация). Показано, что предварительное клонирование популяции вируса перед подготовкой вакцинного штамма снижает вероятность появления адаптационных к субстрату аминокислотных замен в гемагглютинине вакцинного штамма. Подготовленный в культуре клеток MDCK штамм, содержавший Ile131 в HA1, а также штамм, содержавший Asn112 в HA2, обладали сниженной иммуногенностью для морских свинок. Наибольшие показатели гуморального иммунного ответа были достигнуты после иммунизации животных вариантами, подготовленными в развивающихся куриных эмбрионах.
Heterogenicity in amino acid composition of haemagglutinin in nature population of A/New Caledonia/20/99 (H1N1) influenza virus was studied. Amino acid substitutions in haemagglutinin of egg- and MDCK-based cold-adapted reassortants were analyzed. Variable amino acids in 78, 190, 225 (HA1) and 106 (HA2) positions (H3-numbering) were detected. It was shown that vaccine strain development based on cloned wild type virus decreased a possibility of appearance of substrate-adapted amino acid substitutions in haemagglutinin of vaccine strain. MDCK-derived strains with Ile131 in HA1, or with Asn112 in HA2, had reduced immunogenicity for guinea pigs. Maximum humoral immune response values were shown after immunization of guinea pigs with egg-derived vaccine strains.
influenza
live attenuated influenza vaccine
haemagglutinin
mutations
immunogenicity
1. Kiseleva I.V., Alexandrova G.I., Rudenko L.G., Klimov A.I. Influenza virus strain A/17/New Caledonia/99/145 (H1N1) for influenza live intranasal vaccine for adults development. Russian Federation Patent no. 2183672. 08.12.2000. Bull no. 17, 2002.
2. Bullough P.A., Hughson F.M., Skehel J.J., Wiley D.C. Nature, 1994, 371(6492): pр. 37–43.
3. Das S.R., Puigbo P., Hensley S.E., Hurt D.E., Bennink J.R., Yewdell J.W. PLoS Pathog, 2010, 6(11): рp. e1001211.
4. Gambaryan A.S., Marinina V.P., Tuzikov A.B., Bovin N.V., Rudneva I.A., Sinitsyn B.V., Shilov A.A., Matrosovich M.N. Virology, 1998, 247(2): рp. 170–7.
5. Gambaryan A.S., Robertson J.S., Matrosovich M.N. Virology, 1999, 258(2): рp. 232–9.
6. Ha Y., Stevens D.J., Skehel J.J., Wiley D.C. EMBO J, 2002, 21(5): рp. 865–75.
7. Influenza Research Database. Available at http://www.fludb.org (accessed 1.10.2014).
8. Isakova-Sivak I., Chen L.M., Bourgeois M., Matsuoka Y., Voeten J.T., Heldens J.G., van den Bosch H., Klimov A., Rudenko L., Cox N.J., Donis R.O. Clin Vaccine Immunol, 2014, 21(5): рp. 722–31.
9. Isin B., Doruker P., Bahar I. Biophys J, 2002, 82(2): рp. 569–81.
10. Kiefer F., Arnold K., Kunzli M., Bordoli L., Schwede T. Nucleic Acids Res, 2009, 37: рp. D387–92.
11. Kiseleva I., Su Q., Toner T.J., Szymkowiak C., Kwan W.S., Rudenko L., Shaw A.R., Youil R. J Virol Methods, 2004, 116(1): рp. 71–8.
12. Palker T., Kiseleva I., Johnston K., Su Q., Toner T., Szymkowiak C., Kwan W.S., Rubin B., Petrukhin L., Wlochowski J., Monteiro J., Kraiouchkine N., DiStefano D., Rudenko L., Shaw A., Youil R. Virus Res, 2004, 105(2): pр. 183–94.
13. Pierce B., Tong W., Weng Z. Bioinformatics, 2005, 21(8): рp. 1472–8.
14. Rudenko L., van den Bosch H., Kiseleva I., Mironov A., Naikhin A., Larionova N., Bushmenkov D. Vaccine, 2011, 29 Suppl 1: рp. A40–4.
15. Thoennes S., Li Z.N., Lee B.J., Langley W.A., Skehel J.J., Russell R.J., Steinhauer D.A. Virology, 2008, 370(2): pр. 403–14.

Вакцинопрофилактика является наиболее эффективным, безопасным и экономически обоснованным средством борьбы с гриппом. В качестве приоритетного средства профилактики гриппа ВОЗ рекомендует живую гриппозную вакцину (ЖГВ) [14].

Формальным требованием, предъявляемым к гриппозным вакцинам, являются показатели прироста сывороточных антител. Состав внутренних генов вакцинных штаммов ЖГВ постоянен, поэтому основное влияние на иммуногенность вакцинного штамма оказывают свойства гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) эпидемического вируса.

Существуют два основных субстрата, в которых производится культивирование вируса гриппа и получение вакцинных штаммов: развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ) и перевиваемые клеточные линии [8, 11]. Мутации, появляющиеся в поверхностных антигенах вирусов гриппа в процессе адаптации к субстрату, могут оказывать влияние на иммуногенность вакцинного штамма, поэтому исследования одиночных мутаций в молекуле НА штаммов, культивируемых в разных биологических системах, могут помочь в выборе вакцинного кандидата.

Целью исследования было изучение аминокислотного состава НА штаммов ЖГВ, подготовленных на основе вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) в разных биологических субстратах (РКЭ, культура клеток MDCK) и определение их иммуногенности в экспериментах на животных.

Материалы и методы исследования

В работе были использованы полученные из ВОЗ два варианта «дикого» вируса А/Новая Каледония/20/99 (А/NC), выделенные в РКЭ и культуре клеток MDCK, и 4 их реассортанта с донором аттенуации отечественной ЖГВ А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), (табл. 1). Реассортанты были подготовлены в отделе вирусологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН.

Таблица 1

Перечень использованных в экспериментах реассортантных штаммов

Название штамма

Система, в которой изолирован «дикий» родительский вирус

Система, в которой получен реассортант

Автор штамма

25М/1

MDCK1

MDCK

Киселева И.В. [12]

39Е/2

РКЭ2

MDCK

Киселева И.В. [12]

NC1453

РКЭ2

РКЭ

Киселева И.В. [1]

NC84

РКЭ4

РКЭ

Федорова Е.А.4

Примечания: 1№ последовательности HA ISDNAU0001 [7]. 2№ последовательности гемагглютинина AJ344014 [7]. 3Штамм коммерческой ЖГВ A/17/Новая Каледония/99/145. 4Клонированный вариант А/NC. 4Не опубликовано.

Секвенирование последовательности сегментов генома осуществляли с использованием автоматического капиллярного секвенатора 3130x Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Последующая обработка данных производилась с использованием пакета программ Lasergene 7.1 (DNAstar). Моделирование пространственной структуры молекул белков проводилось с использованием сервиса SWISS-MODEL [10], Swiss-PdbViewer 4.1.0 и сервиса ZDOCK [13].

В работе использовались морские свинки (самки–альбиносы) весом 300–350 г, полученные из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» РАМН. Работа с животными проводилась в соответствии с «Правилами лабораторной практики» (Приказ МЗРФ № 708н от 23.08.2010).

Для исследования иммуногенности разных штаммов вируса гриппа морских свинок заражали интраназально в дозе 5 lg ЭИД50 на одну особь. Забор крови и назальных смывов производили через 2, 4 и 8 недель после заражения. В сыворотках определяли содержание вируссспецифических антител к штамму А/NC методами РТГА, микронейтрализации, содержание IgG методом ИФА, в смывах – содержание IgA методом ИФА.

Результаты исследования и их обсуждение

Для изучения состава гетерогенной популяции «дикого» вируса было проведено клонирование «яичного» варианта с последующим секвенированием сегмента генома, кодирующего НА полученных клонов (табл. 2). Также было проведено секвенирование последовательности HA и NA реассортантов, перечисленных в табл. 1. Последовательность сегмента генома, кодирующего нейраминидазу изученных штаммов, не отличалась.

Таблица 2

Отличия в аминокислотной последовательности гемагглютинина вакцинных штаммов на основе вируса гриппа А/NC

Позиция аминокислоты1

Локализация мутации в молекуле НА

Гетерогенность в исходной популяции

Штаммы

25М/1

39Е/2

NC145

NC84

78

Глобулярная часть HA1

Glu/Lys

Glu

Glu

Glu

Lys

131

Thr

Thr

Ile

Thr

Thr

190

Asp/Asn

Asn

Asp

Asp

Asn

225

Asp/Gly

Gly

Asn

Gly

Asp

436 (HA2 106)

Ножка НА2

Arg/Lys

Arg

Arg

Lys

Arg

442 (HA2 112)

Asp

Asn

Asp

Asp

Asp

Примечание. 1 Позиции аминокислот указаны в H3-нумерации.

В HA1 вариабельность была обнаружена в четырех аминокислотных позициях – 78, 131, 190 и 225. Еще две вариабельные позиции располагались в ножке гемагглютинина (аминокислотные остатки 106 и 112) (табл. 2). Аминокислотные позиции, по которым была выявлена гетерогенность, были визуализированы с использованием компьютерного моделирования (рисунок).

pic_53.tif

Расположение вариабельных аминокислотных остатков в молекуле гемагглютинина А/NC. На одном из мономеров показано расположение вариабельных аминокислотных остатков. Разными цветами показано расположение антигенных сайтов Ca, Cb, Sb, Sa [7]. Слева – вид со стороны одного из мономеров. Справа – один из мономеров показан в виде схемы основных элементов структуры, чтобы продемонстрировать аминокислотные позиции 106 и 112 в субъединице HA2, расположенные в центре тримера. Иллюстрация получена с использованием программы RasMol 2.7.5

Варианты вируса, выделенные в разных субстратах, отличались аминокислотной позицией 190: у MDCK-варианта в данной позиции располагается остаток Asn190, у РКЭ-варианта – Asp190 . Замена Asn190 → Asp190 описана в литературе как адаптационная к куриным эмбрионам: изменяется распределение заряда и способность к взаимодействию с рецептором с α-2,3 связью [5]. Реассортанты, подготовленные на основе вирусов, выделенных в разных субстратах, сохраняли аминокислотный остаток в позиции 190: штамм 25М/1 содержал Asn190, штаммы 39Е/2 и NC145 – Asp190. При клонировании «дикого» вируса в РКЭ нам удалось выделить компонент популяции, содержавший Asn190. Данный чистый клон был использован для подготовки вакцинного штамма NC84, и Asn190 сохранился после 6 пассажей в куриных эмбрионах. Это говорит о том, что влияние субстрата не однозначно определяет появление аминокислотной замены, но значительно повышает вероятность отбора субстрат-адаптированных вариантов. Это можно использовать при подготовке штаммов ЖГВ: предварительное клонирование и выбор клона может обеспечить более предсказуемый результат.

Наибольшие различия по показателям иммунного ответа были обнаружены между штаммами, подготовленными в культуре клеток MDCK (25M/1 и 39Е/2) и подготовленными в РКЭ (NC145, NC84) (табл. 3). Значения титров антител были наиболее низкими у штамма 25M/1: средние значения титров антител у животных, вакцинированных штаммом 25М/1, статистически достоверно отличались от значений титров антител в сыворотках животных, вакцинированных штаммами NC145 и NC84, на всех сроках, по результатам всех исследований. Штамм 39Е/2 был более иммуногенен, значения титров антител в данной группе статистически достоверно превышали титры, полученные в результате вакцинации 25М/1, на сроке 8 недель по результатам исследований сывороток тремя методами. Штаммы NC145 и NC84 вызывали статистически достоверно более высокие приросты титров антител, чем штаммы 25M/1 и 39Е/2. Между группами NC145 и NC84 статистически значимых различий обнаружено не было.

Две вариабельные позиции в НА1 не оказали значительного влияния на иммуногенность: это гетерогенная позиция 78 (табл. 2), относящаяся к антигенному сайту Cb [7], и позиция 225, расположенная в петле 220 рецептор-связывающего кармана. 225 позиция, по данным литературы, является вариабельной среди вирусов подтипа H1 [3].

Таблица 3

Среднегеометрические титры антител против вируса гриппа А/NC в сыворотках и назальных смывах морских свинок

Препарат

Метод учета

Срок после вакцинации, недели

Метод учета

Срок после вакцинации, недели

2

4

8

2

4

8

25M/1

РТГА, сыворотки

5,0

9,6

12,9

ИФА IgG3, сыворотки

72,5

262,5

951,0

39E/2

5,0

10,0

29,7

390,1

1159,3

2826,5

NC145

13,5

65,6

144,9

7608,3

20480,0

22611,8

NC84

15,9

40,0

80,0

6450,8

10240,0

16255,0

Плацебо

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

Н1

22,29

11,01

13,39

20,99

19,15

20,14

р2

0,0001

0,0117

0,0039

0,0001

0,0003

0,0002

25M/1

РМН, сыворотки

10,0

16,4

40,0

ИФА IgA, смывы4

< 2

< 2

< 2

39E/2

10,0

26,9

215,3

2,5

2,0

1,6

NC145

195,0

2100,0

5120,0

12,6

32,0

20,0

NC84

50,4

1015,9

2031,9

8,0

10,1

6,3

Плацебо

< 10

< 10

< 10

< 2

< 2

< 2

Н

22,90

20,91

21,70

4,21

5,93

6,12

р

0,0001

0,0001

0,0001

0,2362

0,1152

0,1050

Примечания:

1 значение критерия Краскела – Уоллеса.

2 уровень статистической значимости;

3 определение содержания сывороточных иммуноглобулинов класса G методом ИФА;

4 определение содержания иммуноглобулинов класса А в назальных смывах методом ИФА.

Штамм 39Е/2 за счет замены Thr131 → Ile131 в НА1 потерял потенциальный сайт гликозилирования. Подобная замена описана в исследовании [4] как влияющая на способность НА вируса к связыванию с рецептором. Возможно, именно это стало причиной сниженной иммуногенности данного реассортанта, поскольку по остальным позициям 39E/2 не отличается от более иммуногенных штаммов на основе А/NC.

Среди исследованных нами штаммов были два варианта, содержавшие уникальные замены в НА2 – NC145 и 25M/1. Штамм NC145, обладавший наиболее высокой иммуногенностью по показателям гуморального иммунного ответа, содержал Lys106 в НА2, у остальных исследованных штаммов в данной позиции располагается остаток Arg106. Гетерогенность Arg/Lys в данной позиции характерна для H1-вирусов [15]. Позиция 106 располагается в области оси симметрии тримера HA, в непосредственной близости от пептида слияния, в точке, где длинный α-спиральный участок подвергается анфолдингу при низких pH [2]. Остаток Lys106 формирует водородные связи с Glu103 и взаимодействует с анионами, что стабилизирует структуру в области оси тримера. Arg106 формирует солевые мостики с Glu105, но ионные взаимодействия в области оси тримера значительно слабее [6]. Возможно, Lys106 стабилизировал структуру НА штамма NC145, что и привело к его наибольшей иммуногенности среди исследованных штаммов.

Замена Asp112 → Asn112 в HA2 была обнаружена у штамма 25М/1, обладавшего самой низкой иммуногенностью среди исследованных штаммов, а также сниженными показателями репродукции в развивающихся куриных эмбрионах. По данным литературы, Asp112 формирует 4 водородных связи, стабилизирующих пептид слияния, и мутации в этой позиции приводят к изменению конформации при менее кислых pH [9]. Вероятно, данная мутация изменила свойства НА штамма 25М/1, что привело к более низкой иммуногенности.

Заключение

Вакцинные штаммы на основе вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), содержавшие отдельные аминокислотные замены в НА, обладали разной иммуногенностью по показателям гуморального иммунного ответа в эксперименте на морских свинках. Наиболее высокие показатели гуморального иммунного ответа были достигнуты после иммунизации штаммами, подготовленными в развивающихся куриных эмбрионах. Штаммы, подготовленные в культуре клеток, приобрели уникальные аминокислотные замены в гемагглютинине и вызывали гуморальный иммунный ответ меньшей степени выраженности.

Работа выполнена при поддержке гранта № 14–15–00034 Российского Научного Фонда (Москва, Россия).

Рецензенты:

Жилинская И.Н., д.б.н., ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ, г. Санкт-Петербург;

Рябчикова Е.И., д.б.н., профессор, ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 27.10.2014.