Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

THE ROLE OF VASCULAR CHANGES FROM PHOTOINDUCED RETINAL DAMAGE

Varakuta E.Y. 1 Logvinov S.V. 1 Potapov A.V. 1 Zhdankina A.A. 1 Gerasimov A.V. 1 Anikina E.Y. 1 Sverdeva Y.O. 1
1 Siberian State Medical University
С помощью методов световой и электронной микроскопии изучали сосудистые изменения хориоретинального комплекса при световом воздействии интенсивностью 6000 лк на 40 белых беспородных крысах-самцах. Забор материала производили на 1, 7, 14, 30 сутки после освещения. В аналогичные сроки забирали материал у контрольной группы, которую содержали в идентичных условиях вивария. Морфологические изменения эндотелиоцитов хориокапилляров характеризовались отеком цитоплазмы, вакуолизацией органелл, разволокнением базальной мембраны. Часть эндотелиоцитов подвергалась деструктивным изменениям, что усиливало нарушения гемодинамики. Так, удельная площадь сосудов хориоидеи со стазом, сладжем и тромбозом на 7-е сутки достоверно увеличивалась в 16 раз по сравнению с контролем (р < 0,05), площадь открытых сосудов снижалась в 4,3 раза (контроль 36 ± 0,69; р < 0,05). Прогрессирующее снижение удельной площади функционирующих сосудов приводило к нарушению перфузии и ишемии наружных слоев сетчатки, что сопровождалось их очаговым выпадением и стимулировало неоангиогенез, вызвавший вторичные дегенеративные изменения сетчатки.
The vascular changes in the chorioretinal complex from light exposure with 6000 lux intensity were studied in 40 white outbred male rats using light and electron microscopy. The objects were extricated on the 1st, 7th, 14th, 30th day after the exposure. At the same time the extrication of the retinas was performed on the control group which had been kept in the same terms of vivarium. The morphological changes of the endothelial cells of the choroid capillaries found are as follows: the swelling of cytoplasm, vacuolation of organelles, fiber destruction of the basement membrane. Some of the endothelial cells were prone to destruction, which increased hemodynamic instability. The total area of choroid capillaries showing stasis, sludge, thrombosis was 16 times as big compared to the control group (p < 0,05) on the 7th day, while the total area of unaffected choroid capillaries decreased 4,3 times (control group; p < 0,05). The progressive decline of the area of functioning capillaries led to perfusion disorder and ischemia of the outer retinal layers, accompanied by their uneven loss. It stimulated neoangiogenesis, which induced secondary degenerative retinal changes.
retina
choroid
photoinduced damage
1. Bogolepov N.N. Meditsina, 1979, p. 168.
2. Varakuta E.Yu. Avtoref. dis. d-ra med. nauk, Tomsk, 2008, p. 39.
3. Logvinov S.V, Plotnikov M.B., Varakuta E.Yu, Zhdankina A.A., Potapov A.V. Byulleten sibirskoy biologii i meditsiny, 2005, no. 11, pp. 591–594.
4. Ostrovskiy M.A, Fedorovich I.B. Biofizika, 1994, T 2, Vol. 1, pp. 13–15.
5. Plotnikov M.B., Tyukavkina N.A., Plotnikova T.M. Tomsk, izdatelstvo Tomskogo yniversiteta, 2005, pр. 228.
6. Ausprunk D.H., Folkman J. Microvasc. Res, 1977, Vol. 14, no 1, pp. 53-65.
7. Becerra S.P, Fariss R.N., Wu Y.Q. Exp. Eye Res, 2004, Vol.78, pp. 223–234.
8. Boulton M. Rozanowska M., Rozanowski B. Photochem. Photobiol, 2001, Vol. 64, no 2–3. pp. 144–161.
9. Kayatz P., Heimann К., Schraermeyer U. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1999, Vol. 40, pp. 2314–2321.
10. Ogata N., Wada M., Otsuji Т. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2002, Vol. 43, pp. 1168–1175.
11. Wu T., Handa J.T.,Gottsch J.D. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2005, Vol. 46, pp. 1117–1123.
12. Zeng Y., Li. G., Fan B. Byulleten sibirskoy biologii i meditsiny, 2007, T. 143, no.3, pp. 293–297.

Известно, что световое воздействие вызывает поражение всех клеточных элементов сетчатки [2, 3], механизм которого связан с фотоокислением мембранных структур
[4, 8]. Тяжесть поражения сетчатки во многом зависит от степени расстройства микроциркуляции, так как сетчатка, являясь представителем нервной ткани, чувствительна к гипоксии. Постоянный и непрерывный приток глюкозы и кислорода из кровеносного русла является необходимым условием энергетического обеспечения нервных клеток. Даже при кратковременной гипоксии в нервной ткани резко падает образование АТФ, следствием чего является быстрое развитие необратимых изменений в ткани мозга [1].

Цель исследования – изучение морфологических изменений сосудистых элементов сетчатки и их вклада в развитие процессов деструкции и репарации сетчатки при высокоинтенсивном световом воздействии.

Материал и методы исследования

Эксперименты проведены на 40 белых беспородных половозрелых крысах-самцах массой 200–250 гр. На крыс экспериментальной группы (20 животных) воздействовали в течение 6 час. белым светом, имеющим максимум излучения в желто-зеленой области спектра. Для облучения использовалась специальная установка из прямоугольных рефлекторов с вмонтированными в них люминесцентными лампами ЛБ-40, освещающая клетку с пяти сторон. Освещенность животных составляла 6000 лк. Контрольная группа (n = 20) – интактные животные, содержавшиеся в условиях искусственного светового режима (12 часов в день, 12 часов в ночь), с интенсивностью дневного освещения 25 лк. Материалом исследования служили сетчатки крыс, изъятые сразу после их умерщвления под эфирным наркозом через 1, 7, 14 и 30 суток после освещения, в аналогичные сроки производили взятие контрольного материала.

Центральные участки задней стенки глаза фиксировали в растворе, содержащем смесь 4 % параформальдегида и 0,5 % глютаральдегида на 0,2 М какодилатном буфере (рН 7,4). Материал постфиксировали в 2 % растворе четырехокиси осмия и заливали в эпон. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим, ультратонкие – контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали и фотографировали в электронном микроскопе JEM-7 А. На полутонких срезах с помощью окулярной измерительной сетки Автандилова высчитывали удельную площадь открытых и тромбированных сосудов хориоидеи. Для оценки достоверности различий при сравнении средних величин использовали непараметрический критерий Манна – Уитни.

Результаты исследований
и их обсуждение

На 1-е сут. после светового воздействия, в эндотелиоцитах хориокапилляров наблюдается отек цитоплазмы, вакуолизация большинства органелл. Вероятно, при повышенной световой нагрузке происходит срыв адаптации и окислительное повреждение эндотелиоцитов. Так, P. Kayatz et al. [9] обнаружили транспорт продуктов пероксидации от фоторецепторов к хориокапиллярам. T. Wu et al [11] после освещения зеленым светом интенсивностью 3500 лк в течение 3 часов выявили окислительное повреждение ДНК эндотелиоцитов, перицитов и пигментоцитов (ПЦ).

Дисфункция эндотелия нарушает транспорт метаболитов в пигментоциты и обратный транспорт продуктов обмена. Это приводит к их накоплению в цитоплазме клетки и гибели ПЦ. Цитоплазма таких клеток резко осмиофильна и вакуолизирована, ядра пикнотичны. Кроме того, повреждение эндотелия стимулирует тромбообразование. Тромбоциты выделяют воспалительные цитокины, вызывая хемотаксис лейкоцитов, которые в свою очередь индуцируют апоптоз эндотелиоцитов. Свободные радикалы и продукты перекисного окисления липидов увеличивают ригидность мембран эритроцитов и снижают их способность к деформации, что приводит к задержке форменных элементов в микроциркуляторном русле [5]. Все перечисленные процессы вызывают увеличение удельной площади сосудов со стазом, сладжем форменных элементов и тромбозом сосудов до 7,6 ± 0,5 % (контроль 1,52 ± 0,08 %; р < 0,05) (рис. 1), а также снижение количества открытых сосудов до 20 ± 2,93 % (контроль 36 ± 0,69 %; р < 0,05) (рис. 2).

pic_16.wmf

Рис. 1. Удельная площадь сосудов хориоидеи со стазом, сладжем и тромбозом при световом воздействии (6000 лк). Примечание. * – достоверность различий (p < 0,05)
при сравнении с показателями контрольных животных

pic_17.wmf

Рис. 2. Удельная площадь открытых неизмененных сосудов хориоидеи глаз крыс при световом воздействии (6000 лк). Примечание. # – достоверность различий (p < 0,05)
при сравнении с показателями контрольных животных

Нарушение перфузии приводит к ишемии наружных слоев сетчатки, не имеющих собственной сосудистой сети. Это, наряду с прямым повреждающим действием света, приводит к очаговому выпадению наружных слоев сетчатки на 7-е сут. после высокоинтенсивного светового воздействия. В очагах поражения наблюдается резкое истончение слоев, образованных нейросенсорными клетками. Встречаются участки, в которых отсутствуют все наружные слои сетчатки, и ассоциативные нейроны внутреннего ядерного слоя оказываются вплотную приближены к мембране Бруха. В области дефектов базального комплекса наблюдаются сосудистые почки, что сопровождается прорастанием новообразованных сосудов хориоидеи в сетчатку (рис. 3).

pic_18.tif

Рис. 3. Структурные изменения сетчатки на 7-е сутки после освещения в очаге поражения. Глиальная пролиферация и новообразованный сосуд в наружном ядерном слое:
ГП – глиальная пролиферация; НОС – новообразованный сосуд. Полутонкий срез.
Окраска толуидиновым синим. Ув. 900

В участках, окружающих дефект, наблюдается усиленная пролиферация пигментоцитов (ПЦ). Обнаружено, что в ПЦ синтезируются два фактора-антагониста. Фактор роста пигментоцитов (PEDF) выделяется через апикальную часть клетки, ингибирует ангиогенез [10], а также обладает нейропротекторным действием. Фактор роста эндотелиоцитов (VEGF) при нормальных условиях функционирования выделяется в небольших количествах через базальную часть пигментоцита и стимулирует активность хориоидального эндотелия [7].

Очевидно, в патологических условиях нарушается баланс, и VEGF начинает выделяться в больших количествах, кроме того, гипоксия индуцирует экспрессию HIF-1α фактора, что инициирует неоваскулогенез [12]. По данным D.N. Ausprunk et J. Folkman [6] в новообразованных сосудах практически отсутствует базальная мембрана. Они очень хрупкие и легко кровоточат.

Очаги поражения сетчатки совпадают по размерам и локализации с изменениями сосудов хориоидеи. Просвет большинства сосудов в очагах в экспериментальной группе резко сужен, причем одни из них не имеют форменных элементов, в других наблюдаются явления тромбоза, стаза и сладжа, что сопровождается резким снижением удельной площади открытых сосудов (рис. 2) до 8,4 ± 0,69 % (контроль 36 ± 0,69 %; р < 0,05) и значительным ростом удельной площади сосудов хориоидеи со сладжем форменных элементов и тромбозом (рис. 1) до 24,4 ± 0,4 % (контроль 1,52 ± 0,08 %; р < 0,05).

На светооптическом уровне сосудистая стенка выглядит утолщенной. При исследовании ультраструктуры хориокапилляров выявляется неравномерное утолщение и разволокнение базальной мембраны эндотелиоцитов, а также дегенеративные изменения части эндотелиоцитов, проявляющиеся деструкцией ядра (пикноз, рексис, лизис) и цитоплазмы (гомогенизация и сморщивание). Обнаруживается неравномерное утолщение базального комплекса вследствие пролиферации волокнистого компонента.

Интраретинальные сосуды проявляют относительную резистентность к повреждающим воздействиям. При электронно-микроскопическом исследовании сосудов сетчатки со стороны стекловидного тела на первый план выступают изменения перикапиллярных элементов радиальной глии. Отростки глиоцитов, окружающие капилляр, отечны, обладают низкой электронной плотностью. В цитоплазме этих отростков выявляются вакуоли, большое число лизосом и фагосом. Перикапиллярное пространство расширено. Базальная мембрана капилляров обладает повышенной электронной плотностью, неравномерной толщиной. Цитоплазма эндотелиоцитов бедна органеллами, содержит пиноцитозные везикулы и крупные вакуоли.

Наибольшая сохранность интраретинальных сосудов во внутренних слоях сетчатки, вероятно, связана с защитными свойствами радиальной и астроцитарной глии, которые выделяют трофические факторы, уменьшающие деструкцию эндотелия, а также с относительной удаленностью от нейросенсорных клеток – основного источника свободных радикалов и продуктов перекисного окисления липидов.

К 14–30-м суткам после освещения в очагах сетчатки с полным отсутствием пигментоцитов и нейросенсорных клеток базальный комплекс утолщен, местами разволокнен, большинство гемокапилляров замещены малодифференцированными клетками фибробластического ряда. В сохранившихся сосудах хориоидеи наблюдается вакуолизация цитоплазмы эндотелиоцитов, снижение количества органелл. Морфометрический анализ показал, что к 30-м суткам после освещения в очагах поражения наблюдается максимальное число тромбированных сосудов – 29,4 ± 0,34 % (контроль 1,52 ± 0,08 %; р < 0,05) и минимальное число открытых сосудов – 4,4 ± 0,27 % (контроль 36 ± 0,69 %; р < 0,05).

Заключение

Обнаружено, что наиболее восприимчивы к повреждающему действию света сосуды хориоидеи, чем интраретинальные гемокапилляры. Деструкция эндотелия, а также гемодинамические нарушения приводят к очаговому выпадению наружных слоев сетчатки и прорыву гематоретинального барьера, что индуцирует сосудистое новообразование. Неоангиогенез, с одной стороны, является адаптивной реакцией, направленной на восстановление крово­снабжения сетчатки, а с другой стороны – ставит нейроны сетчатки в непривычные условия функционирования и инициирует вторичные дегенеративные изменения.

Рецензенты:

Солонский А.В., д.м.н., руководитель лаборатории нейробиологии, ФГБУ «Научно-исследовательский институт психического здоровья» СО РАМН, г. Томск;

Мустафина Л.Р., д.м.н., профессор ка-
федры гистологии, эмбриологии и цитологии, ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Томск.

Работа поступила в редакцию 24.10.2014.