Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

TOPOGRAPHY OF PROLIFERATING CELLS IN EMBRYOID BODIES AND FEATURE OF REPRODUCTION OF EMBRYOID BODIES OF TERATOKARCINOMA OF CBA9H6

Dyban P.A. 1 Noniashvili E.M. 1
1 Insitute of Experimental Medicine of the North-West Branch of the RAMS
Изучены количественные показатели размножения эмбриоидных телец малодифференцированной тератокарциномы СВА9Н6 в брюшной полости мышей линии СВА (прирост в % за 1 сутки, время удвоения количества телец) в различные сроки после трансплантации (от 5 до 20 суток). Установлено, что прирост числа эмбриоидных телец и время их удвоения по мере длительности нахождения в брюшной полосы уменьшается. В статье обсуждаются причины замедления темпов образования телец, в частности, является ли это явление истинным или ложным, т.е. обусловленным за счет феномена трансформации асцитной формы (эмбриоидных телец) тератокарциномы в солидную. Установлена статистически достоверная разница в распределении клеток тератокарциномы СВА9Н6 внутреннего слоя эмбриоидного тела: 66 % ± 13,2 от общего числа митотически делящихся и 63 % ± 11,4 синтезирующих ДНК клеток находятся в наружной трети и лишь 8,0 % ± 2,0 и 11 % ± 2,5 во внутренней трети соответственно.
Quantitative indices of reproduction of embryoid bodies of teratocarcinoma CBA9H6 in an abdominal cavity of mice of the CBA line (a gain in % in 1 days, time of doubling of quantity of bodies) in various terms (from 5 to 20 days) after transplantation are studied. It is established that the number gain of the embryoid bodies and time of their doubling in the process of stay duration in an abdominal cavity decreases. In article the reasons of delay of rates of embryoid bodies formation are discussed, in particular, is this phenomenon true or false, i.e. caused by the phenomenon of transformation of an ascitic form of embryoid bodies of a teratocarcinoma to solid. Statistically the following reliable difference in distribution of cells of a teratocarcinoma of CBA9H6 of an inside layer of an embryoid bodies is established: 66 % ± 13,2 from total number mitosis and 63 % ± 11,4 synthesizing DNA cells which are in an external third, and only 8,0 % ± 2,0 and 11 % ± 2,5 – in an internal third, respectively.
teratocarcinoma
embryoid bodies
reproduction
stem cells
proliferation
1. Dyban A.P., Dyban P.A. Stem cells in experimental and clinical medicine // Medical academic Journal. 2002. Vol. 2. no. 3. рр. 3–24.
2. Dyban P.A. Character of growth and differantiation of teratocarcinoma ОС15S1 in syngenic and allogenic mice // Bull. Exp. Biol. and Med. 1984. no. 1. рр. 71–72.
3. Peyron A., LimousinH. Sur la polyembryonie intravasculaire et les metastases a tissues multiples dans les embryomes du testicule // C.r.Acad.Sci. 1936. Vol. 203 рр. 894–896.
4. Stevens L.C. Studies on transplantable testicular teratomas of strain 129 mice. // J. Natl.Cancer Inst. 1958, Vol. 20. рр. 1258–1276
5. Rosenstraus M.J. Sundell C.L., Liskay R.V. Cell cycle characteristics of undifferentiated and differentiating embryonal carcinoma cells // Developmental Biology 1982 Vol. 89. no. 2. рр. 516–520.
6. Sennerstan R., Stromberg J.O. Dissociation of cell Gtowth and DNA Synthesis and alteration of the Nucleo Cytoplasmic Ratio in Growing Embryonal Carcinoma Cells // Development, Growth and Differentiation. 1991. Vol. 33. no. 4. рр. 353–363.

Как известно, эмбриоидные тельца были вначале описаны в тератомах семенника и яичника человека [3]. В дальнейшем, путем трансплантации зародышей в эктопические места и последующих перевивок были получены различные перевивные линии тератокарцином, одни из которых являлись полипотентными, а другие обладали ограниченным модусом дифференцировки [4], но все из них, как в условиях in vivo, так и in virtro формировали эмбриоидные тельца, наружный слой которых был представлен одним слоем энтодермальных клеток, а внутренний – стволовыми тератокарциномными клетками и их потомками, находящихся на разной стадии дифференцировки. При трансплантации в брюшную полость эмбриоидные тельца начинают интенсивно размножаться, а некоторые из них, адгезируя с клетками брюшины, начинают трансформироваться в солидные опухоли. За эти годы были получены многочисленные данные о биологии тератокарцином, в том числе характеризующие процессы дифференцировки стволовых клеток различных линий [1]. Однако малоизученными остаются аспекты, связанные с кинетикой пролиферации стволовых клеток тератокарциномы [2, 5, 6], в частности отсутствуют данные об особенностях их топографии в пределах эмбриоидного тельца и темпах размножения последнего.

Материалы и методы исследования

В работе была использована асцитная форма тератокарциномы (эмбриоидные тельца линии CBA9H6), ранее полученная проф. Грехемом из зародышей мышей линии СВА. В брюшную полость 64 мышей-реципиентов (самцов линии СВА, весом 18–20 г) трансплантировали по 5000 эмбриоидных телец. Через 5,8,13 и 20 суток после трансплантации в брюшную полость мышей-реципиентов вводили 5 мл среды 129, а затем извлекали 1 мл ранее введенной жидкости и подсчитывали в ней количество телец. Мышам внутрибрюшинно вводили Н-3тимидин (удельная активность 17 Кю/ммоль) из расчета 40 мкКю на животное. Подсчет количества ДНК синтезирующих клеток производили через 1 и 30 часов после внутрибрюшинного введения изотопа. Препараты с экспонированной эмульсией типа «М» экспонировали в течение 30 суток. Асцитные и солидные формы тератокарциномы подвергали гистологической обработке, а серийные срезы окрашивали гематоксилин-эозином и азаном по Генденгайну. Полученные данные подвергались статистической обработке по методу Фишер – Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Данные о темпах размножения эмбриоидных телец тератокарциномы СВА9Н6 с суженным модусом цитодифференцировки приведены в табл. 1. Эти данные свидетельствуют о том, что по мере удлинения срока нахождения эмбриоидных телец в брюшной полости темпы прироста клеток асцитной формы опухоли СВА9Н6 уменьшаются, а время ее удвоения соответственно возрастает. Так, например, в ранние сроки после трансплантации (5–8 суток) прирост за 1 сутки эмбриоидных телец возрастает на 198 %, в то время как при более длительном сроке (13–20 суток) лишь на 17,4 %. В свое время нами было установлено, что по мере перехода стволовых клеток тератокарциномы OC15S1 на путь цитодифференцировки, происходит увеличение продолжительности митотического цикла [2]. Не исключено, что замедление темпов образования дочерних эмбриоидных телец может быть объяснено тем, что по мере пребывания в брюшной полости асцитной формы тератокарциномы СВА9Н6 впоследствии возрастания дифференцировки стволовых клеток и соответственно уменьшения темпов пролиферации увеличивается и период формирования критической массы клеток, столь необходимой для разделения материнского эмбриоидного тельца. Однако нельзя не обратить внимание на тот факт, что примерно через 8–9 суток после трансплантации можно обнаружить и переход части асцитной формы тератокарциномы в солидную из-за прикрепления эмбриоидных телец, имеющую более высокую степень дифференцировки, к внутренним органам. Поэтому замедление прироста и времени удвоения эмбриоидных телец, скорее всего не истинное, а ложное (или, по крайней мере, не столь выраженное) за счет феномена трансформации асцитной формы опухоли в солидную.

Таблица 1

Темпы размножения эмбриоидных телец СВА9Н6 в различные сроки после интраперитонеальной трансплантации мышам линии СВА

Время после перевивки (в сутках)

Количество телец в 1 мл жидкости

Абсолютный прирост за исследуемый период

Прирост телец за 1 сутки

Прирост телец за 1 сутки (в %)

Время удвоения количества телец (в часах)

5

1265 ± 390

8

8780 ± 2400*

7515 (6,9 раза)

2505

198

12,1

13

43900 ± 9523*

35120 (4 раза)

7024

80

30,0

20

97500 ± 10655*

53600 (1,5 раза)

7653

17,4

138,0

 

Примечание. *Р < 0,05.

Ранее нами были получены данные о топографии пролиферирующих клеток (синтезирующих ДНК и митозов), которые не были опубликованы в научной статье (табл. 2). Обнаружено, что подавляющее большинство синтезирующих ДНК и митотически делящихся клеток находится в наружной трети внутреннего слоя эмбриоидного тельца. Статистический анализ выявил достоверную разницу в локализации пролиферирующих элементов (как митозов, так и ДНК синтезирующих клеток), находящихся в наружной трети, по сравнению с внутренней третью внутреннего слоя. Таким образом, в результате данного исследования в эмбриоидных тельцах тератокарциномы СВА9Н были выявлены зоны, имеющие камбиальное значение. В этой же работе была предпринята попытка определить миграцию эмбриокарциномных клеток внутри самого эмбриоидного тельца, используя в качестве маркера Н-3 тимидиновую метку с отставлением, т.е. при сопоставлении локализации меченных тимидином клеток через 1 и 30 часов после введения изотопа. Однако возрастание количества меченных клеток во внутренней трети внутреннего слоя с параллельным уменьшением числа аналогичных клеток в наружной трети оказалось статистически недостоверным, т.е. эта тенденция не может служить доказательством миграции эмбриокарциномных клеток из периферического слоя во внутренний. Для окончательного ответа на данный вопрос необходимы дополнительные эксперименты с более длительным по времени отставлением метки.

Таблица 2

Топография синтезирующих ДНК и митотически делящихся клеток тератокарциномы СВА9Н6 во внутреннем слое эмбриоидного тельца

Части внутреннего слоя эмбриоидного тельца

В % от общего числа

На единицу площади

Митозы

Клетки, синтезирующие ДНК (1 час после введения изотопа)

Клетки с отставленной меткой (30 часов после введения изотопа)

Митозы

Клетки, синтезирующие ДНК (1 час после введения изотопа)

Клетки с отставленной меткой (30 часов после введения изотопа)

Наружная треть, граничащая с эндодермальным слоем

66 ± 13,2

63 ± 11,4

44 ± 10,0

0,26 ± 0,05

0,83 ± 0,16

0,61 ± 0,1

Средняя треть

26 ± 5,2

26 ± 6,0

34 ± 7,1

0,15 ± 0,02

0,48 ± 0,06

0,66 ± 0,03

Внутренняя треть

8,0 ± 2,0*

11 ± 2,5*

22 ± 3,0

0,06 ± 0,01*

0,24 ± 0,05*

0,58 ± 0,1

 

Примечание. *Р < 0,05.

Заключение

Полученные нами данные о топографии синтезирующих ДНК и митотически делящихся клеток свидетельствуют о том, что в эмбриоидных тельцах тератокарциномы СВА9Н6, внутренний слой которых представлен компактно сгруппированными клетками, имеются четко выраженные зоны пролиферирующих клеток, находящиеся преимущественно в наружной трети внутреннего слоя. Особенности динамики размножения внутри брюшной полости эмбриоидных телец обусловлены не только темпами деления эмбриоидных телец, но и, вероятно, и параллельным процессом – переходом асцитной формы тератокарциномы в солидную.

Рецензенты:

Пигаревский П.В., д.б.н., доцент, руководитель отдела морфологии, ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург;

Паткин Е.Л., д.б.н., профессор, руководитель лаборатории эпигенетики, ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург.

Работа поступила в редакцию 10.12.2014.