Республика Узбекистан относится к регионам Центральной Азии, где широко распространены хронические гепатиты вирусной этиологии [2, 3, 9]. В последние годы широкое распространение получили хронические гепатиты и цирроз смешанной этиологии [7, 17]. Присоединение инфекции другой этиологии приводит к ускорению декомпенсации функции печени и может привести к смерти больного [20, 23]. Вместе с тем на фоне хронических гепатитов (ХГ) присоединение вторичной инфекции специфической этиологии может усугубляться синдромом субклеточного роста бактерий, изменяется их спектр и активность со сдвигом в сторону их агрессивности; тяжело поддаются общепринятому лечению [4, 21]. Особое место в этой проблеме отводится риску развития инфекционных осложнений у больных ХГ, сочетанной с сальмонеллезной инфекцией [5,18], которая является одной из самых распространенных инфекций не только на территории Узбекистана, но и во всех регионах мира [5, 11].
В настоящее время NO рассматривают как сигнальную молекулу пищеварительной системы, так как он стимулирует расслабление гладких мышц пищевода, желудка, тонкой и толстой кишки, желчного пузыря, сфинктера печеночно-поджелудочной ампулы (Одди) [19, 22]. В физиологических условиях эндогенный NO – один из медиаторов внешней секреции поджелудочной железы, секреции секреторными и слизеобразующими клетками слизистой оболочки (СО) желудка и кишечника, устойчивости и неспецифической и специфической защиты СО от действия внутренних и внешних агрессивных факторов среды [13, 14]. Можно полагать, что с нарушениями в активности NOS усиливаются процессы проникновения через СО желудка и кишечника в местную систему кровообращения, а затем через воротную вену в печень экотоксинов и тем самым усиливается нагрузка на детоксикационную активность гепатоцитов, что еще в большей степени осложняет тяжесть развития патологического процесса, увеличивает попадание в общую циркуляцию и в ткани СО желудка и кишечника при сальмонеллезе эндотоксинов. Вместе с тем в литературе есть разные сведения о состоянии NOS в СО желудка и кишечника, ее роли в патогенезе при сочетанном действии ХГ и сальмонеллезной инфекции, что определяет актуальность проблемы и необходимость проведения исследований в этом направлении.
Цель работы – оценить уровень NO, активность эндотелиальной и индуцибельной NOS (е NOS и iNOS), концентрацию пероксинитрита (ОNO2-) в динамике развития патологического процесса в слизистой оболочке желудка и тонкого кишечника при сальмонеллезной интоксикации у животных с патофизиологической моделью хронического гепатита.
Материал и методы исследования
В работе использовано 120 белых беспородных крыс-самцов массой 100–120 гр. Животные были распределены на 4 группы: 1-я группа – животные с острым экспериментальным сальмонеллезом; 2 – хроническим гелиотриновым гепатитом; 3 – на фоне хронического гелиотринового гепатита вызвана острая сальмонеллезная инфекция, 4 – контрольная группа. Для воспроизведения модели сальмонеллезной инфекции животным внутрижелудочно однократно вводили штамм S.typhi murium из расчета 1 млрд микробных тел на 100 г массы животных. Животных под рауш наркозом забивали методом мгновенной декапитации на 1, 4, 7, 10-е сутки после их заражения.
Хронический гелиотриновый гепатит (ХГГ) воспроизводили пероральным введением раствора гелиотрина, подкисленного соляной кислотой (рН 7,0) из расчета 50 мг/кг (5 мг гелиотрина на 100 г) массы тела один раз в неделю на протяжении 42 дней по методике Н.Х. Абдуллаева и соавт. [1]. Летальность составила 8 %. Животных забивали на 60, 90 и 120 дни от начала эксперимента. Согласно данным предыдущих исследований [10] более выраженные признаки хронического гепатита были обнаружены на 90-й день эксперимента, на основании этого заражение сальмонеллезной инфекцией проводили в этот период развития патологического процесса в печени.
Состояние NOS в надосадочной жидкости гомогенатов слизистой желудка и кишечника оценивали по концентрации основных стабильных метаболитов NОх нитратов и нитритов (NО2- и NО3–) по методу П.П. Голикова [6], активности NO-синтаз (NOS): эндотелиальной (еNOS) – по В.В. Сумбаеву и И.М. Ясинской [16] и индуцибельной (iNOS) А.С. Комарина и Р.К. Азимова, [8], а также уровень пероксинитрита (ОNO2-) определяли по методу А.С. Комарина и Р.К. Азимова [15].
Опыты проводили в соответствии с международными нормами, принятыми при работе с экспериментальными животными.
Результаты исследования обработали с помощью прикладных программ Statistica 6, Biostat. Данные представлены в виде средних арифметических значений (М) и стандартных отклонений (m). Для сравнения выборок применяли t-критерий Стьюдента. Уровень значимости считали достоверным при Р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
В группе животных с ХГГ отмечается с увеличением срока наблюдения в СО желудка и кишечника динамическое снижение концентрации основных стабильных метаболитов NO. Уменьшение концентрации NO, можно полагать, было связано ее снижением в тканях СО желудка и кишечника активности еNOS. Среди причин низкой активности еNOS в СО желудка и кишечника при ХГГ важным фактором, по-видимому, выступает экспрессия ОNO2– как следствие инициации активности iNOS. При активации iNOS образуются высокие концентрации NO, которые в условиях патологии клетки вступают в реакции с супероксидным кислородом (O2–) с образованием ОNO2– [8]. Следовательно, полученные результаты показали, что при ХГГ в тканях СО желудка и кишечника наблюдается выраженная дисфункция эндотелия (ДЭ), характерной особенностью которой является снижение уровня NO. Учитывая, что 90-е сутки ХГГ проявляется выраженными нарушениями функции эндотелия в СО желудка и кишечника и в дальнейшем отмечается прогрессирование ДЭ, нами выбран именно этот срок как отправная точка для исследований сочетанной патологии ХГГ + сальмонеллезная инфекция. Необходимо подчеркнуть, что развитие сальмонеллезной интоксикации в отличие от ХГГ проявляется статистически значимым повышением в СО желудка и кишечника NO по сравнению с группой животных после 90-х суток опыта и контролем (таблица). Другие показатели NOS – еNOS, iNOS и ОNO2– имели ту же направленность в СО желудка и кишечника, что и при ХГГ. При развитии сальмонеллезной инфекции на фоне ХГГ отмечается, что с увеличением срока наблюдения отмечается прогрессирующее увеличение в СО желудка и кишечника уровня NO, снижение активности еNOS, экспрессия iNOS и NO2–. Выявленная различная направленность в изменении уровня NO в СО желудка и кишечника, можно полагать, была продиктована различным механизмом воздействия на NOS факторов среды. По-видимому, при ХГГ активность еNOS снижается вследствие действия на ткани СО желудка и кишечника эндотоксинов, поступающих в центральный кровоток из печени, одновременно инициируют iNOS и образование ОNO2–, которые приводят к угнетению еNOS. Вместе с тем при сальмонеллезной интоксикации на активность еNOS в тканях СО желудка и кишечника одновременно воздействуют эндотоксины и патогенная флора сальмонеллезной инфекции как внешний агрессивный фактор и образующие эндотоксины – липополисахариды (ЛПС) клеточной стенки грамотрицательных бактерий, проникающие через СО желудка и кишечника в местную систему кровообращения, через воротную вену в печень, а затем в общий кровоток, вызывающий поражение всего организма, в том числе в сосуды микроциркуляции интестинальных ворсин СО желудка и кишечника [12]. В наших исследованиях это проявляется потенцирующим эффектом действия токсинов, сальмонеллезной инфекции и эндотоксинов образующихся в печени при ХГГ на угнетение активности в СО желудка и кишечника активности еNOS, инициацией iNOS, образования ОNO2– важного цитотоксического/цитостатического соединения, усиливающего пролиферативные и проапоптотические процессы [24], как следствие, высокого уровня деградации и десквамации интестинального эпителия СО желудка и кишечника.
Показатели NOS в СО желудка и кишечника при сальмонеллезной инфекции у животных с ХГГ, M ± m
|
Показатель |
Контрольная группа |
ХГГ, сут. |
Сальмонеллез, сут. |
ХГГ + сальмонеллез, сут. |
||||||||
|
60 |
90 |
120 |
1 |
4 |
7 |
10 |
1 |
4 |
7 |
10 |
||
|
NO, мкмоль/л |
||||||||||||
|
В СО желудка |
2,3 ± 0,1 |
2,1 ± 0,05 |
1,8 ± 0,03* |
1,7 ± 0,03* |
2,8 ± 0,09*,∆ |
3,1 ± 0,13*,∆ |
3,9 ± 0,17*,∆ |
4,6 ± 0,16*,∆ |
3,4 ± 0,15*,∆,о |
5,9 ± 0,129*,∆,о |
7,7 ± 0,29*,∆,о |
10,4 ± 0,36*,∆,о |
|
В СО кишечника |
10,6 ± 0,47 |
9,2 ± 0,27 |
7,9 ± 0,17* |
7,2 ± 0,15* |
15,1 ± 0,44*,∆ |
20,4 ± 0,84*,∆ |
23,5 ± 0,87*,∆ |
30,8 ± 1,36*,∆ |
18,6 ± 0,67*,∆,о |
26,5 ± 1,19*,∆,о |
34,1 ± 1,09*,∆,о |
40,3 ± 1,41*,∆,о |
|
еNOS, мкмоль/мин/л |
||||||||||||
|
В СО желудка |
6,2 ± 0,29 |
5,8 ± 0,17 |
4,9 ± 0,16* |
4,4 ± 0,09* |
4,2 ± 0,22*,∆ |
3,4 ± 0,20*,∆ |
2,6 ± 0,17*,∆ |
2,2 ± 0,18*,∆ |
3,3 ± 0,14*,∆,о |
2,2 ± 0,15*,∆,о |
2,0 ± 0,15*,∆,о |
1,7 ± 0,11*,∆,о |
|
В СО кишечника |
9,3 ± 0,44 |
8,3 ± 0,30 |
6,7 ± 0,22* |
6,3 ± 0,17* |
6,1 ± 0,19*,∆ |
5,3 ± 0,25*,∆ |
4,8 ± 0,24*,∆ |
4,0 ± 0,15*,∆ |
5,2 ± 0,25*,∆,о |
4,4 ± 0,21*,∆,о |
3,6 ± 0,13*,∆,о |
2,9 ± 0,12*,∆,о |
|
iNOS, мкмоль/мин/л |
||||||||||||
|
В СО желудка |
0,10 ± 0,005 |
0,11 ± 0,005 |
0,16 ± 0,020* |
0,19 ± 0,032* |
0,15 ± 0,004*,∆ |
0,18 ± 0,006*,∆ |
0,23 ± 0,008*,∆ |
0,27 ± 0,011*,∆ |
0,18 ± 0,005*,∆,о |
0,27 ± 0,012*,∆,о |
0,36 ± 0,0010*,∆,о |
0,43 ± 0,014*,∆,о |
|
В СО кишечника |
0,15 ± 0,006 |
0,17 ± 0,011 |
0,25 ± 0,016* |
0,31 ± 0,024* |
0,31 ± 0,009*,∆ |
0,45 ± 0,015* |
0,66 ± 0,018*,∆ |
0,72 ± 0,024*,∆ |
0,53 ± 0,021*,∆,о |
0,87 ± 0,030*,∆,о |
1,03 ± 0,040*,∆,о |
1,65 ± 0,073*,∆,о |
|
ОNO2–, мкмоль/л: |
||||||||||||
|
В СО желудка |
0,04 ± 0,002 |
0,05 ± 0,007 |
0,10 ± 0,011* |
0,15 ± 0,018* |
0,18 ± 0,006*,∆ |
0,25 ± 0,007*,∆ |
0,47 ± 0,017*,∆ |
0,68 ± 0,029*,∆ |
0,42 ± 0,015*,∆,о |
0,63 ± 0,017*,∆,о |
0,98 ± 0,04*,∆,о |
1,50 ± 0,044*,∆,о |
|
В СО кишечника |
0,13 ± 0,006 |
0,14 ± 0,010 |
0,23 ± 0,016* |
0,28 ± 0,012* |
0,52 ± 0,021*,∆ |
0,77 ± 0,026*,∆ |
1,12 ± 0,046*,∆ |
1,72 ± 0,060*,∆ |
0,83 ± 0,031* |
1,21 ± 0,039*,∆,о |
1,58 ± 0,062*,∆,о |
2,13 ± 0,095*,∆,о |
Примечания: * – Р < 0,05 по отношению к контролю;
∆ – Р < 0,05 по отношению к гр. 90 сут ХГГ;
о – Р < 0,05 по отношению к гр. сальманеллезом.
Таким образом, в результате исследований установлено, что в механизме синдрома эндогенной интоксикации, высокой пролиферации эпителия в СО желудка и кишечника лежат процессы ДЭ, что еще в большей степени способствует агрессивности желудочно-кишечной микрофлоры, вызванной сальмонеллезной инфекцией и ее транслокации, которые еще в большей степени усиливаются на фоне ХГГ.
Выводы
1. Инфекционный процесс при сальмонеллезной инфекции в СО желудка и кишечника потенцируется фактором развитием ХГГ, что подтверждается более выраженным угнетением активности еNOS, экспрессией iNOS, ОNO2– и NO по сравнению с аналогичными показателями, когда патологический процесс развивается в этих органах раздельно.
2. Динамика изучаемых показателей ДЭ в СО желудка и кишечника имеет однонаправленность при сочетанной патологии и не зависит от этиологических факторов, вызванных ХГГ, сальмонеллезной инфекции и/или при смешанной патологии.
Работа выполнена по фундаментальному гранту ФДСС 12-14 «Роль факторов апоптоза в патогенезе защитного барьера слизистой оболочки желудка и кишечника при сальмонеллезной инфекции и хронических гепатитах (экспериментальные исследования)» Министерства здравоохранения Республики Узбекистан.
Рецензенты:Юлдашев Н.М., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической, бионеорганической и биоорганической химии, Ташкентский педиатрический медицинский институт, г. Ташкент;
Саидов А.Б., д.м.н., директор НИИ гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения Республики Узбекистан, г. Ташкент.
Работа поступила в редакцию 19.12.2014.