Кровопотеря – патологический процесс, который приводит к изменениям в системе макро- и микроциркуляции, транскапиллярного обмена и кислородно-транспортной функции крови, в результате чего развивается гипоксия, как циркуляторная, так и гемическая. Кроме того, гемодинамические нарушения осложняются вторичной тканевой гипоксией [6,10]. Такой сложный патогенез нарушений кислородного режима организма при кровотечениях обуславливает как выраженные патофизиологические сдвиги, так и сложность их патогенетической коррекции.
Важнейшими механизмами нарушений гомеостаза при кровопотере являются изменения, происходящие на уровне клеточных и субклеточных биологических мембран. Универсальным молекулярным механизмом регуляции физико-химических свойств мембран клеток и нарушения их структурно-функциональных свойств являются процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) [4, 8]. Стресс-реакция, гипоксия, сопровождающие кровопотерю, являются патофизиологической основой усиления процессов ПОЛ [2, 13].
Высокая интенсивность процессов, происходящих в печени, обуславливает ее высокую чувствительность к недостатку кислорода. Печень является одним из основных органов, регулирующих обмен липидов [4]. Кровопотеря вызывает нарушение различных функций печени [9]. Можно предположить, что в нарушении метаболизма при кровопотере важную роль играет активация ПОЛ в печени, в результате чего могут происходить изменения липидного состава мембран и, как следствие, сдвиг функционального состояния печени.
Установлено, что кровопотеря интенсифицирует процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах. Эти изменения отражают увеличение функциональной нагрузки на сохранившиеся эритроциты, а с другой стороны, могут быть обусловлены метаболическими расстройствами вследствие кровопотери [9]. Так, из данных литературы известно, что метаболиты, образующиеся в гепатоцитах, особенно в мембранах их эндоплазматической сети и поступающие в кровеносное русло, при патологии печени могут индуцировать нарушения целостности мембран и внутриклеточного метаболизма эритроцитов [11]. В данных условиях важно состояние антиоксидантной защиты клеток.
С целью коррекции постгеморрагических нарушений патогенетически оправдано применение антиоксидантных средств, стабилизирующих метаболизм гепатоцитов и, как следствие, метаболизм эритроцитов. Перспективным в этом отношении можно считать направленный транспорт веществ в аутологичных эритроцитарных тенях, благодаря их тропности к клеткам Купфера [14]. Для исследований нами была выбрана аскорбиновая кислота, антиоксидантные свойства которой характеризуются широким спектром инактивирующего действия на различные свободные радикалы [3]. Однако в определенных условиях АК оказывает прооксидантный эффект. Так, было показано, что при его взаимодействии с железом усиливается пероксидация липидов, что приводит к повреждению клеточных мембран [3, 12].
Цель исследования – изучить процессы ПОЛ и состояние антиоксидантной системы (АОС) в эритроцитах крыс после кровопотери и оценить возможность коррекции обнаруженных биохимических нарушений с помощью направленного транспорта аутологичных эритроцитов с аскорбиновой кислотой в печень.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на белых беспородных крысах массой 240−280 г. Гипоксию вызывали кровопусканием через катетер [15]. Объем кровопотери составил 2 % от массы животного. Животные были разделены на следующие группы: 1-я группа – интактные животные, 2-я группа – крысы с кровопотерей (материал для исследования брали через 6 и 24 ч после кровопотери), 3-я группа – интактные животные, получавшие АК внутривенно (контрольная группа), 4-я группа – животные с кровопотерей, получавшие АК внутривенно. В каждой группе по 12 животных. Получение эритроцитарных контейнеров (ЭК) с АК производилось методом гипотонического лизиса в модификации Т.П. Генинг [5]. ЭК с АК вводили внутривенно в дозах 25, 50 и 100 мг/кг однократно через 10 мин после кровопотери. Состояние процессов ПОЛ оценивали путем определения малонового диальдегида (МДА) [1] в эритроцитах. Для оценки состояния АОС определяли активность каталазы [7] и глутатионредуктазы (ГР) [7] в эритроцитах белых крыс.
Поскольку распределение в выборках не отличалось от нормального, для оценки достоверности различий между группами использовали метод парных переменных (t-критерий Стьюдента) Excel (Windows 2010). Различия между группами считали достоверными при р < 0,05. Экспериментальные исследования проводились с соблюдением биоэтических правил.
Результаты исследования и их обсуждение
Исследование влияния кровопотери на содержание в эритроцитах крыс продукта ПОЛ – МДА показало, что через 6 ч после кровопотери его концентрация достоверно возросла на 15,34 % (с 573,25 ± 42,92 мкмоль/л до 661,17 ± ± 9,77 мкмоль/л) (р < 0,05). Через 24 ч после кровопотери мы наблюдали более существенное увеличение данного показателя: содержание МДА достоверно возросло на 21,58 % относительно исходных значений (р < 0,05).
В ускорении процессов ПОЛ в эритроцитах при кровопотере наряду с внутриклеточными механизмами важная роль принадлежит дополнительным негативным воздействиям на эритроциты гуморальных факторов, содержащихся в плазме. Их природа и механизм действия остаются неясными. Известно, что при кровотечении происходит активация различных ферментных систем, а это приводит к накоплению в крови биогенных аминов и других физиологически активных веществ, обладающих прооксидантным действием [11].
При введении АК в дозе 25 мг/кг животным после кровопотери уровень содержания МДА в эритроцитах через 6 ч после кровопотери имел тенденцию к снижению, а через 24 ч – наоборот, к повышению по сравнению с его уровнем у интактных животных. По сравнению с крысами с кровопотерей содержание продукта ПОЛ – МДА достоверно снизилось на 14,91 % (с 661,17 ± 39,77 мкмоль/л до 562,56 ± 53,28 мкмоль/л), а через 24 ч – лишь имело тенденцию к снижению.
Однократное внутривенное введение АК в ЭК в дозе 50 мг/кг животным после кровопотери через 6 ч способствовало снижению содержания МДА в эритроцитах крыс с 573,35 ± 42,92 мкмоль/л до 464,43 ± 41,45 мкмоль/л, что составило 81 % по сравнению с интактными животными, а через 24 ч его содержание лишь имело тенденцию к снижению по сравнению с таковыми. Относительно данных животных с кровопотерей содержание МДА снизилось через 6 ч на 29,76 % (с 661,17 ± 39,77 мкмоль/л до 464,43 ± 41,45 мкмоль/л), а через 24 ч – на 26,56 % (с 696,98 ± 57,76 мкмоль/л до 511,24 ± 44,81 мкмоль/л).
При введении АК в ЭК в дозе 100 мг/кг животным после кровопотери через 6 ч содержание МДА достоверно повысилось на 27,81 %, а через 24 ч – на 25,81 % по сравнению с интактными животными. По сравнению с животными с кровопотерей содержание МДА через 6 ч достоверно повысилось на 10,83 % (с 661,17 ± 39,77 мкмоль/л до 732,78 ± 54,64 ммоль/л), а через 24 ч лишь имело тенденцию к повышению.
Результаты исследования, представленные в табл. 2, показывают, что однократное введение АК в ЭК в дозе 25 мг/кг на обоих изученных сроках животным после кровопотери не вызывает достоверного изменения уровня ГР по сравнению с ее уровнем у крыс с кровопотерей. В то же время, анализируя данные таблицы, можно отметить: при введении АК после предварительного включения ее в эритроцитарные носители активность ГР через 6 ч после кровопотери имеет тенденцию к повышению, а через 24 ч – к понижению. При этом, по сравнению с интактными животными, введение АК в дозе 25 мг/кг способствует достоверному снижению уровня ГР в эритроцитах: через 6 ч – на 20,8 % (с 42,5 ± 8,5 мкмоль/л до 33,7 ± 5,2 мкмоль/л), а через 24 ч – на 26,09 % (с 42,5 ± 8,5 мкмоль/л до 31,4 ± 4,8 мкмоль/л).
Однократное внутривенное введение АК в ЭК животным после кровопотери в дозе 50мг/кг способствовало достоверному повышению активности фермента на обоих изученных сроках по сравнению с его активностью у животных с кровопотерей. Так, через 6 ч его активность достоверно повысилась до 50,1 ± 5,4 мкмоль/л, а через 24 ч – до 43,9 ± 6,8 мкмоль/л, что соответственно в 1,56 и в 1,26 раз выше уровня его активности у животных с кровопотерей. По сравнению с показателями интактных животных активность ГР через 6 ч достоверно повысилась на 17,78 % с 42,5 ± 8,5 мкмоль/л до 50,1 ± 5,4 мкмоль/л, а через 24 ч лишь имела тенденцию к повышению.
Анализ полученных данных показал, что уровень активности ГР при введении АК в ЭК в дозе 50 мг/кг после кровопотери оставался выше уровня активности ГР в эритроцитах интактных животных и через 6 ч (р < 0,05), и через 24 ч (р > 0,05) после кровопотери.
При введении АК в ЭК животным после кровопотери в дозе 100 мг/кг прослеживается тенденция к снижению активности ГР на обоих исследованных сроках по сравнению с животными с кровопотерей. По сравнению с интактными животными активность ГР через 6 ч после кровопотери достоверно снизилась на 26,32 % (с 42,5 ± 8,5 ммоль/л до 31,3 ± 4,6 ммоль/л), а через 24 ч – на 27,85 % (с 42,5 ± 8,5 ммоль/л до 30,7 ± 4,0 ммоль/л).
При введении АК в ЭК в дозе 25 мг/кг уровень активности каталазы через 6 ч достоверно повысился на 28,43 % (с 53,7 ± 4,6 ммоль/л до 69,0 ± 1,1 ммоль/л), а через 24 ч – на 22,35 % (с 53,7 ± 4,6 ммоль/л до 65,8 ± 1,2 ммоль/л) по сравнению с интактными животными. По сравнению с животными с кровопотерей уровень активности фермента статистически достоверно повысился через 6 ч на 6,53 % (с 64,8 ± 1,5 ммоль/л до 69,0 ± 1,1 ммоль/л), а через 24 ч на 10 % (с 59,8 ± 7,5 ммоль/л до 65,8 ± 1,2 ммоль/л).
Таблица 1
Влияние внутривенного введения АК в дозировках 25 и 50 мг/кг на уровень МДА (мкмоль/л) в эритроцитах белых крыс (М ± m, n = 12 в каждой группе)
|
№ п/п |
Условия эксперимента |
МДА (мкмоль/л) |
||
|
1 |
Интактные животные |
573,25 ± 42,92 |
||
|
2 |
6 ч после кровопотери |
661,17 ± 39,77* |
||
|
3 |
24 ч после кровопотери |
696,98 ± 57,76* |
||
|
Использованные дозы аскорбиновой кислоты для коррекции кровопотери |
25 мг/кг |
50 мг/кг |
100мг/кг |
|
|
4 |
Контроль |
571,67 ± 34,37* |
486,30 ± 42,41* |
601,33 ± 35,26 |
|
5 |
ЭК с АК (6 ч) |
562,56 ± 53,28 |
464,43 ± 41,45*^ |
732,78 ± 54,64 |
|
6 |
ЭК с АК (24 ч) |
590,78 ± 51,36* |
511,24 ± 44,81*^ |
721,33 ± 34,15 |
Примечания. * – достоверность различий по отношению к интактным животным, достоверны при р < 0,05; ^ – достоверность различий по отношению к животным с кровопотерей, достоверны при р < 0,05.
Таблица 2
Влияние внутривенного введения АК в дозировках 25, 50 и 100 мг/кг на активность каталазы (ммоль/л) и ГР (мкмоль/л) в эритроцитах белых крыс (М ± m, n = 12 в каждой группе)
|
Условия эксперимента |
Каталаза (ммоль/л) |
ГР (мкмоль/л) |
||||||
|
Интактные животные |
53,7 ± 4,6 |
42,5 ± 8,5 |
||||||
|
6 ч после кровопотери |
64,8 ± 1,5* |
32,0 ± 5,8* |
||||||
|
24 ч после кровопотери |
59,8 ± 7,5* |
34,7 ± 8,0* |
||||||
|
Условия эксперимента |
Использованные дозы АК |
|||||||
|
25 мг/кг |
50 мг/кг |
100м г/кг |
||||||
|
каталаза |
ГР |
каталаза |
ГР |
каталаза |
ГР |
|||
|
Контроль |
60,5 ± 1,4* |
38,2 ± 6,3 |
62,1 ± 5,8* |
35,5 ± 11,8 |
26,9 ± 4,6* |
36,7 ± 5,3 |
||
|
ЭК с АК (6 ч) |
69,0 ± 1,1*^ |
33,7 ± 5,2* |
58,8 ± 4,3^ |
50,1 ± 5,4*^ |
37,7 ± 2,3*^ |
31,3 ± 4,6* |
||
|
ЭК с АК (24 ч) |
65,8 ± 1,2*^ |
31,4 ± 4,8* |
52,4 ± 3,9^ |
43,9 ± 6,8^ |
30,9 ± 2,4*^ |
30,7 ± 4,0* |
||
Примечания. * – достоверность различий по отношению к интактным животным, достоверны при р < 0,05; ^ – достоверность различий по отношению к животным с кровопотерей, достоверны при р < 0,05.
Как показывают полученные данные (табл. 2) при введении АК в эритроцитарных носителях в дозе 50 мг/кг только через 6 ч после кровопотери активность каталазы имеет тенденцию к повышению по сравнению с интактными животными. Через 24 ч после кровопотери при введении АК в эритроцитарных носителях уровень активности каталазы, наоборот, имеет тенденцию к снижению по сравнению с интактными животными. По сравнению с животными с кровопотерей уровень активности каталазы достоверно снижается через 6 ч после кровопотери на 9,32 % (с 64,8 ± 1,5 ммоль/л до 58,8 ± 4,3 ммоль/л), а через 24 ч после кровопотери на 12,3 % (с 59,8 ± 7,5 ммоль/л до 52,4 ± 3,9 ммоль/л).
Введение АК в ЭК в дозе 100 мг/кг животным после кровопотери вызывает достоверное снижение активности каталазы через 6 ч с 64,8 ± 1,5 ммоль/л до 37,7 ± 2,3 ммоль/л, а через 24 ч – с 59,8 ± 7,5 ммоль/л до 30,9 ± 2,4 ммоль/л, что составляет соответственно 58,50 % и 51,63 % по сравнению с животными с кровопотерей. По сравнению с интактными животными активность каталазы достоверно снизилась через 6 ч на 29,83 %, а через 24 ч – на 42,58 %.
Выводы
1. На фоне кровопотери активируются процессы перекисного окисления липидов в эритроцитах, о чем свидетельствует увеличение в них уровня малонового диальдегида.
2. Введение АК с использованием эритроцитарных носителей в дозе 25 мг/кг способствовало нормализации содержания МДА в эритроцитах. В дозе 50 мг/кг АК оказывала выраженный антиоксидантный эффект (значительно снижалось содержание продукта ПОЛ – МДА). В дозе 100 мг/кг АК, включенная в эритроцитарные носители, выступала в роли прооксиданта.
3. Использование АК в дозе 25 мг/кг сохраняет повышенный уровень активности каталазы, а в дозе 100 мг/кг, наоборот, приводит к понижению его активности по сравнению с животными с кровопотерей. В то же время АК в дозе 50 мг/кг нормализует уровень активности каталазы в эритроцитах.
4. Направленный транспорт АК в эритроцитарных носителях в печень в дозе 50 мг/кг через 6 ч вызывал повышение активности ГР в эритроцитах крыс, а через 24 ч способствовал его нормализации. При введении низких (25 мг/кг) и высоких (100 мг/кг) доз АК у крыс не наблюдалось повышения уровня активности ГР в эритроцитах.
Рецензенты:Каталымов Л.Л., д.б.н., профессор кафедры анатомии, физиологии и гигиены человека и животных ФГБОУ ВПО «Ульяновского государственного педагогического университета им. И.Н. Ульянова», г. Ульяновск;
Любин Н.А., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой морфологии, физиологии и патологии животных ФГБОУ ВПО «Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии имени П.А. Столыпина», г. Ульяновск.
Работа поступила в редакцию 02.02.2015.