Природный газ Астраханского газоконденсатного месторождения (АГКМ) представляет собой чрезвычайно сложную химическую систему, уникальность которой обусловлена высоким содержанием серы и в особенности сероводорода [1, 4]. Высокая токсичность сероводорода делает Астраханский природный газ чрезвычайно агрессивным агентом, вызывающим развитие окислительного стресса [2, 6]. Последнее обстоятельство является причиной возникновения функциональных нарушений многих систем организма. В последнее время все больше внимания уделяется исследованию влияния сероводородсодержащего газа Астраханского газоконденсатного месторождения на репродуктивную систему мужчин [7, 8, 13], поскольку большая часть рабочего контингента на Астраханском газоконденсатном комплексе – мужчины, что определяет исследование именно мужской репродуктивной системы. Вместе с тем в литературе приводится мало сведений, касающихся профилактики нарушений репродуктивной функции в условиях стресса. В исследованиях последних лет говорится о протекторных свойствах антиоксидантов в условиях развития окислительного стресса. Это касается, прежде всего, функциональных возможностей такого классического антиоксиданта, как витамин E [15]. Однако об альтернативных корректорах репродуктивной функции в условиях интенсификации процессов свободнорадикального окисления (СРО) говорится мало.
Целью настоящей работы является изучение корректирующих эффектов селенсодержащего биокомплекса, состоящего из селексена и аскорбиновой кислоты, на морфофункциональное состояние семенников экспериментальных животных в условиях воздействия сероводородсодержащим газом АГКМ.
Материалы и методы исследования
Для исследования взяли 40 половозрелых самцов белых крыс массой 200 ± 10 г. Эксперименты на животных осуществлялись в соответствии с требованиями Женевской конвенции (1985). Животные были разделены на 4 группы: одна контрольная (К) и три опытные. В первую опытную группу (О-1) вошли животные, получавшие перорально селексен в сочетании с аскорбиновой кислотой в дозах соответственно 1,5 и 500 мг/кг массы тела животного в сутки в течение 50 дней. Группу О-2 составили животные, подвергавшиеся воздействию сероводородсодержащим газом (СВСГ) с концентрацией 10 мг/м3 по сероводороду в течение 30 дней по 4 часа ежедневно. В группу О-3 вошли животные, получавшие селексен в сочетании с аскорбиновой кислотой в указанных дозах в течение 50 дней, а параллельно с третьей недели введения указанных препаратов подвергавшиеся воздействию СВСГ в указанной концентрации в течение 30 дней по 4 часа ежедневно. По окончании экспериментальных воздействий в крови определяли уровень перекисного гемолиза эритроцитов [9]. В ткани семенников определяли исходный уровень малонового диальдегида (МДА) и кинетические показатели ПОЛ [12]. Состояние сперматогенеза у животных оценивали по методу, предложенному В.П. Маминой и Д.И. Семеновым [5]. Эпидидимальные сперматозоиды извлекали из хвостовой части эпидидимисов, разрезая их вдоль, семенную жидкость вымывали дозированным количеством физиологического раствора (эмпирически для крыс это количество 2–4 мл) и получали суспензию [11]. Подсчёт общего числа эпидидимальных сперматозоидов в суспензии производили в камере Горяева под окуляром светового микроскопа при увеличении 600х. Число спермиев подсчитывали в 5 больших квадратах камеры Горяева по диагонали. Кроме того, определяли процентное соотношение между различными морфологическими формами сперматозоидов (дефективные, подвижные и мёртвые). Для общей оценки морфофункционального состояния тестикулярной ткани изготовляли срезы семенников толщиной 7 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином. Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием критерия Стьюдента (t), различия считали достоверными при p < 0,05 [3].
Результаты исследования и их обсуждение
Под действием СВСГ АГКМ обнаружено достоверное снижение относительной массы надпочечников (P < 0,01), что указывает на развитие затяжной стресс-реакции. В пользу указанного обстоятельства свидетельствует также усиление перекисного гемолиза эритроцитов на 23,1 %, по сравнению с контрольной группой (65,3 ± 3,44 и 42,2 ± 3,49 % соответственно), что отражает факт интенсификации процессов СРО в крови и развитие окислительного стресса. Развитие окислительного стресса, сопряжённого с радикальным окислением ненасыщенного фосфолипида RH, можно выразить следующей схемой [6]:
В условиях воздействия СВСГ АГКМ в ткани семенников отмечалось усиление динамики процессов СРО. Исходный уровень МДА в 1,5 раза превосходил контрольное значение (табл. 1). Кинетические показатели ПОЛ в условиях стресса также достоверно возрастали, особенно асПОЛ. Вместе с тем селенсодержащий биокомплекс (селексен + аскорбиновая кислота) способствовал снижению исходного уровня МДА как при воздействии СВСГ, так и в его отсутствие, что указывает на проявление указанным биокомплексом антиоксидантных свойств (рис. 1).
Таблица 1
Изменение показателей ПОЛ в ткани семенников в условиях воздействия сероводородсодержащим газом АГКМ
|
Условия опыта |
n |
МДАисх, нмоль/0,05 г |
Кинетические показатели, нмоль МДА/ч |
|
|
спПОЛ |
асПОЛ |
|||
|
Контроль |
10 |
4,89 ± 0,151 |
45,97 ± 0,840 |
48,74 ± 0,702 |
|
СВСГ АГКМ |
10 |
7,42 ± 0,457 |
65,36 ± 3,104 |
76,48 ± 2,431 |
|
P |
P < 0,001 |
P < 0,001 |
P < 0,001 |
|
Рис. 1. Исходный уровень МДА под действием СВСГ АГКМ, селенсодержащего биокомплекса и их сочетания: ○ – P < 0,05 – в сравнении с группой животных, подвергнутых воздействию газом
В условиях воздействия сероводородсодержащим газом наблюдался отёк интерстициальной ткани, полнокровие сосудов семенников и гибель половых клеток. Семенные канальцы располагались на значительном расстоянии друг от друга. Наблюдалось отслоение базальной мембраны и хаотичное расположение клеток сперматогенного эпителия (а в ряде случаев и вообще запустевание семенных канальцев). Количество клеток Лейдига возрастает примерно в 3 раза за счёт компенсаторного прироста функционально слабых малых клеток (незрелых и инволюционирующих) (рис. 2). Предварительное введение селенсодержащего биокомплекса способствует заметному снижению токсических эффектов, вызываемых одним только токсикантом, что коррелирует с изменением динамики процессов СРО в различных экспериментальных условиях (рис. 3).
Рис. 2. Структура извитых канальцев семенников животных, подвергнутых воздействию сероводородсодержащим газом. Окраска гематоксилин-эозином. Увеличение 200х
Рис. 3. Структура извитых канальцев семенников крыс, подвергавшихся воздействию сероводородсодержащим газом и получавших селенсодержащий биокомплекс. Окраска гематоксилин-эозином. Увел. 200х
Под влиянием сероводородсодержащего газа (опытная группа О-2) отмечалось резкое уменьшение общего количества сперматогенных клеток более чем в 7 раз. Наблюдалось выраженное нарушение соотношения между сперматогенными клетками (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды, сперматозоиды). Содержание сперматогоний и сперматозоидов было сниженным, преобладали сперматоциты и сперматиды. Таким образом, незрелые половые клетки сперматогонии оказались наиболее уязвимым звеном сперматогенеза. Анализ состояния сперматогенеза после воздействия газа на фоне приема селенсодержащего биокомплекса (опытная группа О-3) показал улучшение показателей сперматогенеза, по сравнению с таковыми в группе О-2. Относительное количество сперматогоний и сперматоцитов возросло, что свидетельствует о восстановлении пула незрелых половых клеток под влиянием селенсодержащего биокомплекса в условиях интоксикации газом (табл. 2).
Количество и морфофункциональное состояние эпидидимальных сперматозоидов у белых крыс в норме и в условиях экспериментальных воздействий отражено в табл. 3.
Таблица 2
Состояние сперматогенеза у крыс после воздействия сероводородсодержащим газом
|
Тестикулярные показатели сперматогенеза |
Контроль (n = 10) |
Опытная группа О-2 (n = 10) |
Опытная группа О-3 (n = 10) |
|
Общее количество сперматогенных клеток, млн |
5236 ± 360,0 |
720 ± 38,1 |
2250 ± 116,5 |
|
Сперматогонии, % |
22,5 ± 1,52 |
14,3 ± 0,81 |
17,6 ± 1,02 |
|
Сперматоциты, % |
20,7 ± 1,67 |
28,6 ± 1,88 |
34,2 ± 2,46 |
|
Сперматиды, % |
21,6 ± 1,76 |
35,7 ± 2,59 |
20,3 ± 1,60 |
|
Сперматозоиды, % |
35,2 ± 2,66 |
21,4 ± 1,80 |
27,9 ± 1,41 |
Таблица 3
Состояние эпидидимальных сперматозоидов у крыс под действием сероводородсодержащего газа, селенсодержащего биокомплекса и их сочетания
|
Показатели эпидидимальных сперматозоидов |
Контроль (n = 10) |
Группа О-1 (n = 10) |
Группа О-2 (n = 10) |
Группа О-3 (n = 10) |
|
Общее количество, млн |
50,0 ± 6,51 |
54,3 ± 6,0 |
***28,4 ± 2,44 |
ΔΔ41,0 ± 4,51 |
|
Дефективные, % |
20,2 ± 2,22 |
***13,1 ± 0,62 |
***44,4 ± 3,83 |
ΔΔΔ42,0 ± 3,52 |
|
Подвижные, % |
81,0 ± 6,2 |
88,0 ± 6,11 |
***0,4 ± 0,12 |
ΔΔΔ54,5 ± 4,22 |
|
Мёртвые, % |
4,8 ± 0,82 |
4,7 ± 0,72 |
***55,2 ± 4,11 |
45,4 ± 3,31 |
Примечания: *** P < 0,001 – в сравнении с контролем; ΔΔ P < 0,01; ΔΔΔ P < 0,001 – в сравнении с группой животных, подвергнутых воздействию газом (О-2).
У животных, подвергнутых воздействию газом, отмечено резкое уменьшение общего количества эпидидимальных сперматозоидов более чем в 1,7 раз, в сравнении с контролем (P < 0,001). В популяции сперматозоидов отмечалось увеличение процентного содержания дефективных форм (44,4 %), подвижные сперматозоиды почти отсутствовали (0,4 %). Также почти в 11,5 раз увеличилось содержание мёртвых сперматозоидов (55,2 %) по сравнению с контролем (4,8 %) (P < 0,001). Отсутствие подвижности сперматозоидов связано с таким дефектом, как облом хвоста сперматозоидов, что можно объяснить усилением процесса липопероксидации в условиях развития окислительного стресса, вызванного сероводородсодержащим газом. Вместе с тем предварительное потребление животными селенсодержащего биокомплекса способствовало снижению токсических эффектов сероводородсодержащего газа. Достоверно значимых отклонений от контроля по количеству эпидидимальных сперматозоидов у животных, подвергавшихся воздействию газом и предварительно получавших указанный биопротектор, нами не было зафиксировано. В группе животных, подвергавшихся воздействию газом и предварительно получавших селенсодержащий комплекс, наблюдалось некоторое улучшение морфокинетических характеристик сперматозоидов в сравнении с группой животных, подвергавшихся воздействию только газом.
Известно, что в хвосте сперматозоидов крыс содержится селенопептид, который имеет важное структурное значение при сборке хвоста сперматозоидов [10, 13]. В условиях хронического воздействия сероводородсодержащего газа селен, очевидно, частично замещается серой, имеющей сходство с селеном, что в конечном счете отрицательно сказывается на функциональном состоянии половых клеток. Соответственно, у животных, получавших на фоне воздействия газом органический селен, последний успешно конкурировал с серой за место в селенопептиде, и вследствие этого значительно сокращалось относительное содержание дефективных сперматозоидов и улучшались двигательные характеристики эпидидимальных сперматозоидов.
Таким образом, селенсодержащий биокомплекс, включающий в себя аскорбиновую кислоту и селексен, оказывает протекторный эффект в отношении сперматогенной функции в условиях многократного воздействия сероводородсодержащим газом. Коррекция сперматогенеза достигается двумя путями:
1) за счет снижения интенсивности процессов СРО в ткани семенников;
2) за счет внедрения атомов селена в структуру пептидов, образующих хвостовую часть сперматозоидов.
Аскорбиновая кислота, будучи звеном неферментативной цепи антиоксидантной системы, способствует снижению уровня липопероксидации в тестикулярной ткани, что благотворно в целом сказывается на общем функциональном состоянии. Вместе с тем аскорбиновая кислота способна регулировать уровень селена в организме и выводить его избыток из организма [14]. Селен в органической форме эффективно себя проявляет как строительный материал половых клеток. Кроме того, селен является необходимым компонентом селенсодержащей глутатионпероксидазы, выступающей в качестве звена ферментативной цепи антиоксидантной системы.
Рецензенты:Великородов А.В., д.х.н., профессор, зав. кафедрой фармацевтической химии Астраханского государственного университета, г. Астрахань;
Бойко О.В., д.м.н., профессор кафедры биохимии с курсом лабораторной диагностики, ГБОУ ВПО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Астрахань.
Работа поступила в редакцию 02.03.2015.