Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

PROTEOMIC PROFILE OF THE MUCOSA OF THE SMALL INTESTINE IN NSAID-INDUCED ENTEROPATHY

Atamanyan E.O. 1 Tarasova G.N. 1 Sarvilina I.V. 2
1 Rostov state medical University
2 OOO Medical center «Navomedicine»
Изучен протеомный спектр слизистой оболочки тонкой кишки при НПВП-индуцированной энтеропатии. Протеомный анализ проводили с помощью предварительного фракционирования на магнитных микрочастицах и последующей тандемной времяпролетной MALDI-масс-спектрометрии с использованием биоинформационнных алгоритмов. Идентифицированы 34 белка, для которых установлено изменение продукции (для 16 белков – повышение и для 18 – снижение) при указанном заболевании. Среди них можно выделить белки, участвующие в регуляции воспаления, апоптоза, адгезии, транспорта ионов и других процессов. Выявленные различия в протеомном профиле слизистой тонкой кишки, очевидно, имеют патогенетическое значение в формировании и развитии НПВП-индуцированной энтеропатии. Обсуждается возможное значение дифференциально-экспрессирующихся белков в развитии основных нарушений этой патологии. Обнаруженные белки отличия могут служить маркерами НПВП-индуцированной энтеропатии.
Proteomic spectrum of small intestine’s mucosa with NSAID-induced enteropathy was studied. Proteomic analysis was performed using prefraction on magnetic microparticles and subsequent tandem time-of-flight MAIDI-mass-spectrometry by applying bioinformational algorithms. For 34 identified proteins the change of production (16 proteins – increase, 18 – decrease) has been determined for the indicated disease. Among them there are proteins involved in the regulation of inflammation, apoptosis, adhesion, ion transport and other processes. Educed differences of the small intestine’s mucosa proteomic profile are, obviously, significant for the NSAID-induced enteropathy formation and development. The possible importance of the differential-expression proteins in the development of the major disturbances of this pathology is discussing. Detected proteins of difference can serve as markers of NSAID-induced enteropathy.
proteomic analysis
mucosa
small intestine
NSAID – induced enteropathy
1. Govorun V.M., Archakov A.I. Proteomnye tehnologii v sovremennoj biomedicinskoj nauke. Biohimija, 2002, no. 10, pp. 1341–1359.
2. Gromov P.S., Celis H.Je. Ot genomiki k proteomike. Molekuljarnaja biologija, 2000, no. 4, pp. 597–611.
3. Evseev M.A. Povrezhdenie kishechnoj trubki nesteroidnymi protivovospalitel›nymi preparatami: klinicheskoe znachenie, patogenez, vozmozhnosti profilaktiki, Nevrologija, nejropsihiatrija, psihosomatika, 2013, no.1, pp. 79–87.
4. Karataev A.E., Nasonova V.A, Jenteropatija, inducirovannaja nesteroidnymi protivospalitelnymi preparatami, Terapevticheskij arhiv, 2004, no. 2, pp. 79–82.
5. Alper S.L., Sharma A.K. The SLC26 gene family of anion transporters and channels // Mol. Aspects Med. 2013. Vol. 34, no. 2–3. рр. 494–515.
6. Cao Y., Szabolcs A., Dutta S.K. et al. Neuropilin-1 mediates divergent R-Smad signaling and the myofibroblast phenotype // J. Biol. Chem. 2010. Vol. 285, no. 41. P. 31840–31848.
7. Shishodia S., Aggarwal B.B. Nuclear factor-kappaB activation: a question of life or death // J. Biochem. Mol. Biol. 2002. Vol. 35, no. 1. рр. 28–40.
8. Sunahori K., Yamamura M., Yamana J. et al. The S100A8/A9 heterodimer amplifies proinflammatory cytokine production by macrophages via activation of nuclear factor kappa B and p38 mitogen-activated protein kinase in rheumatoid arthritis // Arthritis Res. Ther. 2006. Vol. 8, no. 3. рр. 69.
9. Thiagarajah J.R., Verkman A.S. CFTR pharmacology and its role in intestinal fluid secretion // Curr. Opin. Pharmacol. 2003. Vol. 3, no. 6. рр. 594–599.

В мировой медицинской литературе представлено огромное количество данных, описывающих побочные эффекты терапии нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП). Хотя токсический потенциал НПВП может быть реализован практически в любом органе и системе, основные побочные эффекты данной группы лекарственных средств закономерно связаны с влиянием на желудочно-кишечный тракт [3]. В тонкой кишке происходит всасывание большей части НПВП при пероральном приеме, что создает условия для локального повреждающего воздействия препаратов и развития НПВП-индуцированной энтеропатии [4].

В настоящее время не вызывает сомнений, что большинство патологических изменений в функционировании клеток, тканей или органов сопровождается отклонением в экспрессии белков – участников конечной стадии передачи информации в клетке [1]. На современном этапе развития молекулярной биологии и медицины наиболее полную информацию о белковом составе исследуемых объектов (протеоме) может дать протеомный анализ. Данный подход подразумевает комплексное изучение протеома методами и технологиями, направленными на одновременное разделение, а также последующую идентификацию и анализ тысячи белков, синтезирующихся в клетке [2]. Использование протеомного анализа в гастроэнтерологии позволяет выяснить ранее неизвестные молекулярные механизмы формирования и развития НПВП-индуцированной энтеропатии, что будет способствовать созданию принципиально новых методов ее прогнозирования и диагностики.

В связи с вышеизложенным целью работы явилось изучение протеомного профиля слизистой оболочки тонкой кишки при НПВП-индуцированной энтеропатии.

Материалы и методы исследования

В течение 2 лет в исследование было включено 20 пациентов с остеоартрозом, принимавших диклофенак в дозе 100 мг/сут в сутки, и верифицированной НПВП-энтеропатией, в возрасте от 25 до 38 лет – 12 (60 %) женщин и 8 (40 %) мужчин. Продолжительность заболевания варьировала от 1 года до 8 лет. Критериями включения в исследование являлись типичные симптомы (боль, чувство «жжения» и тяжести в эпигастральной области), железодефицитная анемия и гипоальбуминемия. Критериями исключения из исследования являлись онкологические заболевания желудочно-кишечного тракта, язвенно-эрозивные повреждения двенадцатиперстной кишки, хирургические операции по поводу заболеваний тонкой кишки в анамнезе, прием антисекреторных и прокинетических лекарственных средств в течение месяца и 15 дней перед включением в исследование. Контрольная группа – 20 практически здоровых лиц. Возраст обследованных колебался в пределах от 37 до 70 лет. Средний возраст пациентов в основной группе – 52,97 ± 2,64 года, в контрольной группе – 36,2 ± 10,2 года. НПВП-энтеропатия верифицирована эндоскопически и морфологически. Материал для общеморфологического и протеомного анализа получали при эндоскопическом исследовании из дистальных отделов двенадцатиперстной кишки.

Для предварительного фракционирования образцов слизистой тонкой кишки использовали стандартные наборы для профилирования, содержащие магнитные микрочастицы с различными поверхностями MB-HIC C8, MB-IMAC Cu, MB-WСХ, согласно методике производителя (Bruker Daltonics, Германия). Подготовка к проведению масс-спектрометрического анализа состояла в следующем: элюаты наносили на стальную мишень AnchorChipTM, после высушивания на воздухе образец покрывали раствором матрицы. В качестве матрицы использовали смесь 2,5-дигидроксибензойной и α-цианогидроксикоричной кислот в смеси метанол/ацетонитрил/вода (5:4:1). Масс-спектры получали с пользованием тандемного MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry)-масс-спектрометра Ultraflex II (Bruker Daltonics, Германия). Спектры калибровали с помощью внешних стандартов, представляющих смесь белков и пептидов с известными массами (Bruker Daltonics, Германия). Каждый масс-спектр был проанализирован с помощью программ FlexAnalysis 3.0 и ClinProTools 2.1 (Bruker Daltonics, Германия). Идентификацию белков и пептидов проводили путем поиска соответствующих кандидатов в базах данных NCBI и SwissProt/UniProt с использованием программы Mascot Search (v 2.1, Matrix Science, Великобритания). Результаты идентификации белков принимались как достоверные при уровне значимости не менее 95 % и показателе сиквенс-покрытия не менее 60 %.

Достоверность различий между протеомными спектрами слизистой оболочки тонкой кишки пациентов контрольной и основной групп определяли с помощью непараметрического χ2-критерия (программа Statistica версия 6.0.). Достоверными считались различия при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Сопоставление протеомного профиля слизистой тонкой кишки пациентов контрольной и основной групп позволило выявить ряд белков отличия, присутствие или отсутствие которых имеет место только при НПВП-индуцированной энтеропатии (таблица). Так, в слизистой оболочке тонкой кишки пациентов основной группы установлено появление 16 белков: субъединицы р-65 фактора NF-kB, кальгранулина, фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), трансформирующего фактора роста-β (ТФР-β), интерлейкина (ИЛ)-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12А, Smad3, PPAR-γ, CFTR, нейропилина 1, β-дефензина-1, HspA8, Hsp27, не обнаруженных у пациентов контрольной группы.

Среди них следует особо выделить транскрипционный фактор NF-kB (субъединица р-65), который контролирует экспрессию ряда генов, участвующих в иммунных и воспалительных реакциях, клеточной адгезии, апоптозе, дифференцировке и пролиферации. Известно, что активация транскрипционного ядерного фактора NF-kB является ключевым моментом в индукции синтеза провоспалительных медиаторов, таких как ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12А и ФНО-α [7]. Сопряженное с возрастанием уровня NF-kB увеличение экспрессии вышеуказанных цитокинов, установленное нами при НПВП-индуцированной энтеропатии, способствует развитию воспалительных процессов в слизистой тонкой кишки. Активации и перемещению в ядро клетки фактора NF-κB способствует кальгранулин А [8], продукция которого также повышена в интерстициальной слизистой у пациентов основной группы.

Увеличение продукции иммунорегуляторного цитокина ТФР-β приводит к усилению экспрессии его цитолазматического медиатора SMAD3 и нейропилина 1 – трансмембранного ко-рецептора, что способствует формированию подслизистого фиброза в стенке тонкой кишки при НПВП-индуцированной энтеропатии за счет индукции синтеза коллагена [6].

Еще один белок с повышенным уровнем CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) – цАМФ-активируемый Cl– канал, локализующийся на мембране энтероцитов [9]. Увеличение продукции белка CFTR при изучаемой патологии приводит к усилению секреции воды в просвет тонкой кишки вследствие повышения секреции Cl– и развитию диарейного синдрома, являющегося одним из побочных эффектов НПВП.

Белки отличия, идентифицированные в слизистой оболочке тонкой кишки пациентов контрольной и основной групп

№ п/п

Название белка

Mm, Да

Номер в базе UniProt

Контр. группа

Основн. группа

p

1

Nuclear factor NF-kappa-B p65 subunit

105356

Q04206

0,001

2

Calgranulin-A

13242

P05109

0,003

3

Heat shock 27 kDa protein (Hsp27)

27000

P04792

0,000

4

Tumor necrosis factor-alfa

25644

P01375

0,035

5

Smad3 (mothers against decapentaplegic homolog 3)

48081

P84022

0,000

6

Transforming growth factor beta 1

44341

P01137

0,08

7

Heat shock 70 kDa protein 8 (HspA8)

70052

P11142

0,035

8

Peroxisome proliferator-activated receptors-gamma protein (PPAR-γ)

57620

P37231

0,047

9

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)

168142

P13569

0,000

10

Interleukin-1beta

30748

P01584

0,001

11

Interleukin-2

17628

P60568

0,003

12

Interleukin-6

23718

P05231

0,045

13

Interleukin-8

11098

P10145

0,008

14

Interleukin-12A

24874

P29459

0,008

15

Neuropilin-1

103134

O14786

0,045

16

Beta-defensin 1

7400

P60022

0,001

17

Carbonic anhydrase I

28870

P00915

0,000

18

Carbonic anhydrase II

29246

P00918

0,000

19

Carbonic anhydrase IV

35032

P22748

0,008

20

Fatty-acid binding protein, intestinal

14208

P12104

0,000

21

Fibronectin

25159

P02751

0,000

22

Laminin subunit gamma-1

204559

P11047

0,000

23

Chromogranin A

50688

P10645

0,000

24

Peptide YY

84505

P10082

0,000

25

Prostaglandin dehydrogenase 1

28977

P15428

0,001

26

Collagen alpha-4(IV) chain

164038

P53420

0,000

27

Glycoprotein A33

35632

Q99795

0,008

28

Somatostatin

12736

P61278

0,000

29

Thiosulfate sulfurtransferase

58263

Q16762

0,000

30

11-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 1

34288

P28845

0,000

31

Vasoactive intestinal polypeptide receptor 1

51547

P32241

0,000

32

Glutathione peroxidases 2

21954

P18283

0,000

33

Sulfate transporter (SLC26A2)

81662

P50443

0,001

34

Chloride anion exchanger (SLC26A3)

84505

P40879

0,001

Примечание. Mm – молекулярная масса, р – достоверность отличий между группами, «↑» – повышение экспрессии белка, «↓» – снижение экспрессии белка.

Компенсаторное значение при данной патологии, очевидно, имеет усиление экспрессии шаперонов HspA8 и Hsp27, которые играют важную роль в защите целостности слизистой оболочки кишечника, уменьшая индукцию апоптоза, вызванную НПВП. Таким же компенсаторным механизмом, очевидно, является увеличение синтеза в слизистой тонкой кишки при НПВП-индуцированной энтеропатии антимикробного пептида β-дефензина-1.

С помощью масс-спектрометрического анализа были идентифицированы 18 белков, экспрессия которых резко снижена или полностью отсутствует в слизистой тонкой кишки при НПВП-индуцированной энтеропатии. К этим белкам относятся интестинальный белок, связывающий жирные кислоты, хлорид-анионный транспортер, белок-переносчик сульфат-ионов, трансмембранный гликопротеин A33, рецептор 1 к вазоактивному интерстициальному пептиду, хромогранин A, пептид YY, соматостатин, глутатионпероксидаза 2, тиосульфат-сульфотрансфераза, простагландин дегидрогеназа 1, 11-β-гидроксистероид дегидрогеназа 1, коллаген IV типа, фибронектин, ламинина (гамма 1 субъединица), карбоангидразы I, II и IV.

Принимая во внимание многочисленные функции соматостатина, пептида YY и хромогранина в ЖКТ (регуляция перистальтики, воспалительных реакций, секреции гормонов и ионов), можно полагать, что снижение продукции этих белков, очевидно, связанное с редукцией числа энтероэндокринных клеток в слизистой кишечника, приводит к расстройствам пищеварения у пациентов, принимающих НПВП.

Уменьшение синтеза карбоангидразы (I, II и IV) создает условия для повреждения слизистого барьера из-за недостаточной продукции этим ферментом бикарбонатов – основных анионов, обеспечивающих защиту эпителия, и может быть причиной эрозивно-язвенных поражений тонкой кишки на фоне длительного приема НПВП.

Установленное снижение экспрессии хлорид-анионного транспортера (SLC26A3) в слизистой тонкой кишки при НПВП-энтеропатии приводит к нарушению поступления ионов хлора в энтероциты и, таким образом, увеличению объема жидкости в просвете кишечника, обусловливая развитие диареи [5].

Что касается глутатионпероксидазы 2, которая защищает клетки от действия активных форм кислорода и апоптоза, то сокращение продукции этого фермента способствует развитию дезорганизационных изменений в эпителии слизистой и снижению его барьерной функции.

Подавление экспрессии при НПВП-индуцированной энтеропатии трансмембранного гликопротеина А33 и белков внеклеточного матрикса – ламинина, коллагена IV типа и фибронектина, играющих важную роль в адгезии энтероцитов, приводит к нарушению межклеточных взаимодействий и, как следствие, увеличению проницаемости кишечного барьера, создавая условия для транслокации бактериальной флоры в кишечную стенку с развитием хронического воспаления.

Заключение

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что модификация экспрессии белков, участвующих в регуляции воспаления, апоптоза, адгезии, транспорта ионов и других важных биологических процессов, является патогенетическим фактором развития НПВП-индуцированной энтеропатии. Полученные нами с помощью протеомного анализа данные позволяют расширить наши представления о молекулярных механизмах развития маркеров данной патологии. Выявленные белки слизистой оболочки кишечника могут быть использованы в качестве информативных маркеров НПВП-индуцированной энтеропатии.

Рецензенты:

Погорелова Т.Н., д.б.н., профессор, заведующая отделом медико-биологических проблем, ФГБУ РНИИАП Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;

Яковлев А.А., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой гастроэнтерологии и эндоскопии с курсом клинической фармакологии ФПК и ППС, ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону.