Акросома секретирует ферменты, которые участвуют в пенетрации сперматозоидами zona pellucida [Abou Haila A., Tulsiani D. R., 2000]. Сериновая протеиназа EC 3.4.21.10 - акрозин, является одним из трех ключевых акросомальных ферментов и играет важную роль в процессе оплодотворения яйцеклетки [Николаев А. А. и др., 2002; Engel W. et al, 2000].
В отдельных работах предлагается определение ферментативной активности акрозина в качестве диагностического теста [Menkveld R. et al, 1996]. Однако, акрозин, как и другие протеолитические ферменты, до определенного момента находится в неактивной форме в комплексе с ингибитором и оценка диагностической значимости этого фермента должна проводится с учетом факторов, влияющих на активность акрозина.
Семенная плазма также содержит мощную протеолитическую систему многофункционального назначения (Watt k et all., 1986). Основным ферментом этой системы является широко известный простатоспецифический антиген ПСА .
Цель нашей работы - исследовать возможное участие ПСА в активации акрозина.
Для реализации этой цели было проведено исследование уровня ПСА в семенной плазме 67 мужчин с различными нарушениями фертильности и контрольной группе. Параллельно проведено исследование активности акрозина.
Определение активности акрозина (EC 3.4.21.10) проводили по методу W. B. Schill [Schill W. B., 1986].
Перед проведением исследования сперматозоиды выделяли после полного разжижения эякулята, путем центрифугирования в градиенте перколла. Все растворы перколла готовили на буфере «HBS+BSA» с рН 8,0 (0,13 М NaCl, 0,004 М KCl, 0,001 М CaCl2, 0,0005 М MgCl2, 0,014 М фруктозы, 0,01 М N-2-гидроксиэтилпиперазин-N¢-2-этансульфоновой кислоты и 1,0 мг/мл бычьего сывороточного альбумина).
Отмытые таким образом сперматозоиды экстрагировали 0,2 М ацетатным буфером с рН 2,4, для диссоциации комплекса акрозина с ингибитором. Отмытые таким образом сперматозоиды экстрагировали 0,2 М ацетатным буфером с рН 2,4, для диссоциации комплекса акрозина с ингибитором.
Активность свободного акрозина определяли по расщиплению синтетического субстрата - ВАЕЕ.
Общую активность акрозина определяли после быстрого оттаивания (при температуре 23°С в течение 30 минут) спермы, предварительно замороженной до -196°С (в жидком азоте).
Проферментную активность рассчитывали по формуле:
ПА = ОА - СА, где
ПА - проферментная активность акрозина, ОА - общая активность акрозина, СА -активность свободного акрозина.
Активность акрозина выражали в международных единицах на 1 миллион сперматозоидов (мкМЕ/106 сп.).
Уровень простатоспецифического антигена определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческой тест-системы фирмы «Вектор-бест»
Таблица 1. Зависимость активности акрозина от концентрации ПСА в семенной плазме
|
Уровни ПСА мгмл |
Активность акрозина (мкМЕ/106 сп.) |
Коэффициент ПА/СА |
|
|
общая |
свободная |
||
|
1,3 - 1,6 |
5,2±0,4 |
1,34±0,24 |
2,88 |
|
1,29 - 0,85 |
5,25±0,27 |
1,46±0,31 |
2,6 |
|
0,84 - 0,65 |
5,19±0,31 |
1,61±0,19 |
2,22 |
|
0,64 - 0,5 |
5,27±0,46 |
1,84±0,34 |
1,86 |
|
0,49 - 0,35 |
5,41±0,22 |
2,18±0,3 |
1,48 |
Полученные данные были объединены в 5 групп в зависимости от концентрации ПСА, причем в первой группе (n= 21) оказался практически весь контрольный контингент и несколько больных с нормоспермией. Как видно из табл.1 по мере убывания концентрации ПСА общая активность акрозина практически не меняется, а свободная активность достоверно отрицательно коррелирует (r= -0.56) с концентрацией ПСА в семенной плазме. Соответственно проферментная активность акрозина уменьшается по мере снижения концентрации ПСА в семенной плазме. Что находит подтверждение в снижении коэффициента ПАCA - общепринятого показателя степени ингибирования акрозина. (Menkveld R. et al, 1996).
Известно, что простатаспецифический антиген является сериновой протеиназой (Watt k et all., 1986) и по нашим предположениям, в соответствии с принципами регуляции ферментной активности, мог бы участвовать в активации акрозина, путем ограниченного протеолиза.
Однако, полученные данные свидетельствуют о существовании более сложного механизма участия протеиназ семенной плазмы в активации ферментов акросомы.
Таким образом, к настоящему времени можно только констатировать участие ферментов семенной плазмы в регуляции процессов капацитации, а конкретные их механизмы требуют дальнейших исследований.