Тетрахлорметан (ТХМ) широко применяется в промышленности как растворитель масел, жиров, каучука, чистки и обезжиривания одежды [11]. Хорошо известно гепатотоксическое действие ТХМ [7, 8, 11], однако установлено, что высокая смертность при острых интоксикациях ТХМ тесно связана и с его иммунотоксическим действием [3, 4]. Попадая в организм, ТХМ оказывает плейотропное повреждающее действие, основным механизмом которого является активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [11]. Это особенно важно для нейтрофилов, поскольку продукция активных форм кислорода является молекулярной основой реализации ими эффекторной функции [2]. Следовательно, оксидативный стресс, вызывая нарушение редокс-статуса нейтрофилов, может существенно нарушить антимикробный потенциал этих клеток [12, 14].
Цель исследования. Изучение эффективности применения оксиметилурацила (ОМУ) - иммуномодулятора с антиоксидантным и гепатопротекторным действием [5, 6, 8, 9, 10], для коррекции повреждающего воздействия ТХМ на функциональное состояние нейтрофилов.
Материалы и методы исследования
Протоколы экспериментов и содержание животных были составлены в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медикобиологических исследований с использованием животных» (1985) и приказа МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». Эксперименты выполнены на 145 белых неинбредных крысах массой 200-220 г. Животные были разделены на 3 группы (по 15 животных в группе): контроль, ТХМ, ТХМ + ОМУ. ТХМ вводили внутрижелудочно в дозе 1,25 мл/кг 50% раствора в оливковом масле на протяжении 4 суток (в -4, -3, -2 и -1 дни) [13]. ОМУ применяли в виде суспензии на 2% крахмальной слизи в дозе 50 мг/кг в течение 7 дней [9], считая день окончания введения токсиканта нулевым днем.
Определяли количество лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови, интенсивность кислородзависимого метаболизма (спонтанный и индуцированный НСТ-тест), поглотительную способность, антимикробную активность полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) в условиях функционирования и блокады (азидом натрия) кислородзависимых факторов микробицидности в отношении грибов Candida albicans, активность миелопероксидазы (МП) и содержание катионных белков (КБ) в нейтрофилах [2, 15]. Активность МП и КБ оценивали по интенсивности окраски, пользуясь 5-балльной шкалой по методу L.S. Kaplow, вычисляли процент активных клеток в мазке (ПА) и средний цитохимический коэффициент (СЦК):
СЦК = (1а + 2в + 3с + 4d)/100,
где 1-4 - интенсивность окраски, а, в, с, d - количество ПМЯЛ с соответствующей интенсивностью окраски [15].
Результаты регистрировали на 7-е, 14-е и 28-е сутки от окончания введения токсиканта. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием методов вариационной статистики [1], пакета программ Statistica 6.0. Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Вилка. При нормальности распределения признака оценку значимости различий проводили с использованием t-критерия Стьюдента, достоверными считали различия при уровне значимости р < 0,05. Данные представлены в% к контролю.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате проведенных исследований установлено, что воздействие токсиканта приводило к формированию лейкопении все сроки наблюдения, обусловленной на 7 сутки лимфопенией (62,1%, p < 0,001), на 14 сутки - равномерным снижением, как нейтрофилов, так и лимфоцитов (до 59,1% (p < 0,02) и 65,9% (p < 0,001) соответственно), а на 28 сутки наблюдалось преимущественное снижение числа нейтрофилов (60,9%, p < 0,001). При этом наблюдалось падение микробицидной способности ПМЯЛ. Двукратное снижение кислородзависимого киллинга ПМЯЛ отмечено на 7 и 14 сутки наблюдения (индекс инактивации (ИИ) составил 59,1% (p < 0,001) и 61,3% (p < 0,001) соответственно), что цитохимически подтверждалось уменьшением активности МП: число МП-позитивных клеток составило 67,9% (p < 0,001) и 72,2% (p < 0,001), а СЦК - 67,8% (p < 0,001) и 72,8% (p < 0,001) (на 7 и 14 сутки соответственно). При этом было отмечено снижение интенсивности кислородзависимого метаболизма ПМЯЛ в условиях индукции (индуцированный НСТ-тест). Полученные данные свидетельствуют об угнетении токсикантом как пероксидазозависимых, так и пероксидазонезависимых оксидантных микробицидных систем ПМЯЛ на 7-е и 14-е сутки наблюдения. Следует отметить глубокое угнетение токсикантом неоксидантных механизмов киллинга: на 7 сутки ИИ снизился более чем в 4 раза (ИИ - 24,8%, p < 0,001), что цитохимически подтверждалось снижением уровня КБ в ПМЯЛ (СЦК - 38,8%, p < 0,001). На 14 сутки активность неоксидантных микробицидных систем повышалась в 2 раза (по сравнению с 7 сутками), но не восстанавливалась (ИИ - 60,5%, p < 0,01), что коррелировало с двухкратным (по сравнению с 7 сутками) повышением уровня КБ в нейтрофильных гранулоцитах (СЦК - 73,2%, p < 0,001).
К 28 суткам наблюдения как кислородзависимая, так и кислороднезависимая микробицидность ПМЯЛ повышалась, не достигая, однако, уровня интактных животных (ИИ составил 84,5% (p < 0,02) и 84,4% (p < 0,01) соответственно). Это сопровождалось снижением активности МП (СЦК - 74,3%, p < 0,01), интенсивности оксидантного метаболизма (индуцированный НСТ-тест) и количества КБ (СЦК - 72,6%, p < 0,001) в ПМЯЛ.
На все сроки наблюдения было отмечено снижение поглотительной способности нейтрофилов (фагоцитарный индекс (ФИ) составил 76,4% (p < 0,001), 78,5% (p < 0,05) и 86,6% (p < 0,05) соответственно).
На 7-е сутки наблюдения применение ОМУ ослабляло выраженность лейкопении за счет увеличения числа лимфоцитов (до 78,9%, p < 0,05). Однако ОМУ не устранял падения микробицидной способности ПМЯЛ в условиях как функционирования, так и блокады оксидантных механизмов киллинга (ИИ составил 50,1 и 34,2% соответственно), что сопровождалось снижением активности МП (СЦК - 71,7%) и уровня КБ (СЦК - 54,0%) в ПМЯЛ, что согласуется с данными других авторов о постепенном наступлении эффекта препарата [6].
На 14-е сутки использование ОМУ устраняло индуцированную токсикантом лейкопению за счет равномерного увеличения как нейтрофилов, так и лимфоцитов (до 93,7% (p < 0,01) и 90,5% (p < 0,001) соответственно). Наблюдалось полное восстановление активности кислородзависимых фунгицидных систем ПМЯЛ (ИИ составил 104,5%, p < 0,001). Это сопровождалось повышением до нормы активности МП (процент МП-позитивных клеток составил 92,5% (p < 0,001), СЦК - 91,0% (p < 0,001)) и активацией оксидантного метаболизма ПМЯЛ (индуцированный НСТ-тест), что свидетельствует о восстановлении под влиянием ОМУ как пероксидазозависимых, так и пероксидазонезависимых оксидантных механизмов киллинга нейтрофилов. Также ОМУ устранял депрессию токсикантом неоксидантных фунгицидных систем ПМЯЛ (ИИ составил 94,4%, p < 0,001), что цитохимически подтверждалось повышением до нормы уровня КБ в нейтрофилах: процент КБ-позитивных клеток составил 111,4% (p < 0,001), СЦК - 110,3% (p < 0,001). Ценно, что применение ОМУ обеспечило снижение до нормы числа ПМЯЛ, участвующих в фагоцитозе (87,7%, p < 0,001) с повышением их поглотительной способности (ФИ - 138,1%, p < 0,01).
На 28 сутки сохранялась индуцированная ТХМ лейкопения. Вместе с тем ОМУ устранял, как и на 14 сутки, депрессию токсикантом кислородзависимых фунгицидных систем ПМЯЛ (ИИ - 91,7%, p < 0,05), что сопровождалось повышением активности МП (процент МП-положительных клеток составил 120,4% (p < 0,001), а СЦК - 118,1% (p < 0,001)) и восстановлением интенсивности оксидантного метаболизма этих клеток. Наблюдалась активация неоксидантных механизмов микробицидности ПМЯЛ (ИИ - 123,4%, p < 0,001), что сочеталось с повышением уровня КБ (СЦК - 94,8%, p < 0,001) в нейтрофилах. Также ОМУ восстанавливал поглотительную способность ПМЯЛ (ФИ - 92,5%), что согласуется с данными других авторов [5].
Выводы
Таким образом, оксиметилурацил в условиях интоксикации ТХМ оказывает значимое корригирующее воздействие на функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов: устраняет депрессию токсикантом оксидантных и неоксидантных факторов микробицидности, повышает интенсивность кислородзависимого метаболизма и восстанавливает поглотительную способность нейтрофилов.
Рецензенты:
Валеева Л.А., д.м.н., профессор, декан фармацевтического факультета, зав. кафедрой фармакологии №2 ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Уфа;
Медведев Ю.А., д.м.н., профессор, научный консультант лаборатории препаратов крови НПО «Микроген» отделение «Иммунопрепарат», г. Уфа.
Работа поступила в редакцию 22.02.2012.