Рак шейки матки (РШМ) является одной из наиболее актуальных проблем современной онкогинекологии, занимая седьмое место среди всех злокачественных опухолей, третье среди злокачественных опухолей у женщин [14] и второе среди раков органов репродуктивной системы [4]. РШМ имеет выраженную тенденцию к нарастанию заболеваемости у женщин репродуктивного возраста [3]. Согласно официальным данным администрации Ульяновской области, заболеваемость населения области неуклонно растет, ежегодно превышая средний показатель по РФ. При этом отмечается рост, как числа заболеваний РШМ, так и смертности от них. Патологоанатомы всегда стремились связать с морфологией опухоли степень ее клинической агрессивности. Одним из наиболее перспективных направлений в диагностике злокачественных опухолей сегодня является определение опухолевых маркеров, характеризующих способность к опухолевой прогрессии клетки - это белки р53, Bcl-2, Ki-67 и ЭФР [6].
Ген-супрессор р53 кодирует ядерный белок, модулирующий экспрессию генов, ответственный за репарацию ДНК, деление клеток и апоптоз [6, 1]. Почти в половине случаев злокачественных опухолей обнаруживаются мутации в хромосоме - 17 в области локализации гена-супрессора р53. На сегодня в литературе нет единого мнения относительно динамики экспрессии р53 при прогрессировании РШМ. Согласно данным ряда авторов, он может, как повышаться, так и снижаться при РШМ [8, 9]. Антиген Ki-67 - это ядерный белок, экспрессия которого отмечается в активную фазу клеточного цикла, включая митоз. Согласно данным литературы экспрессия Ki-67 повышается при поражении шейки матки [5, 7].
Белку Bcl-2 принадлежит важная роль в регуляции апоптоза. Показано, что высокая степень экспрессии опухолевой клетки Bid (белка из семейства Bcl, играющего важную роль в регуляции апоптоза и интегрирующего сигналы для митохондрий), коррелирует с неблагоприятным прогнозом РШМ [15].
Эпидермальный фактор роста (ЭФР) - низкомолекулярный полипептид, который связывается с рецепторами эпидермального фактора роста, как в нормальной, так и патологической клетке. На сегодня идентифицированы по меньшей мере 3 сигнальные системы, которые активируются ЭФР, стимулируя опухолевую прогрессию. Нарушения функциональной активности ЭФР и его рецептора обусловливают более 70% всех злокачественных опухолей. Активация рецепторов ЭФР во всех тканях, вызывая изменения в физиологии клетки: повышается проводимость Na+-каналов, увеличивается приток Са2+, экспрессия ряда онкогенов, синтез ДНК, что приводит к изменению дифференцировки, апоптоза, пролиферации, а также ангиогенез. Наличие рецепторов к ЭФР, как правило, неблагоприятно коррелирует с клинико-морфологическими факторами и является признаком плохого прогноза заболевания [13].
В соответствии с вышеизложенным, целью исследования была оценка уровня экспрессии молекулярно-биологических маркеров p53, Ki-67, Bcl-2 и ЭФР в ткани шейки матки на различных стадиях РШМ.
Материал и методы исследования
Материалом для исследования послужили гистологические препараты операционно-биопсийного материала первичной опухоли 45 больных РШМ, полученные до начала исследования. По стадиям заболевания больные распределились следующим образом: начальный процесс (T Ia1-Ia2) - 15 человек; местно-ограниченный процесс (T Ib IIa) - 15 человек; распространенный процесс (T IIb-IV) - 15 человек.
Образцы опухолевой ткани фиксировали в нейтральном забуференном формалине с обычной стандартной проводкой и заливкой в парафин. Гистологические препараты окрашивали обычными способами и проводили иммуногистохимические исследования. В иммуногистохимической оценке экспрессии mt p53 использовали мышиные моноклональные антитела p53, клон DO-7, Ig G2b (M7001 DakoCytomation) в разведении 1:100 при времени экспозиции 60 минут. Критерием положительной реакции считалась окраска 10% и более ядер опухолевых клеток. Bcl-2 обнаруживался с помощью моноклональных антител к bcl-2, клон bcl-2/100/D5, IgGi (NCL-bcl-2 Novocastra) в разведении 1:80 при инкубации 60 минут Положительной считалась реакция при цитоплазматической и мембранной окраске более 10% опухолевых клеток. Для выявления ЭФР использовали поликлональные антитела (фирма «Dako»). Полученные в ходе исследования результаты подвергнуты обработке с использованием непараметрических статистических методов (Stata 6.0).
Результаты исследования и их обсуждение
В результате проведенных исследований установлено увеличение количества атипичных эпителиальных клеток опухоли, экспрессирующих р53 в динамике опухолевой прогрессии. При этом уровень экспрессии р53 в клетках стромы статистически значимо снижается (рис. 1).
Так в группе пациенток с начальным процессом положительная реакция с антителами к р53 была выявлена в 46,06% случаях. У пациенток с местно-распространенным процессом положительная реакция была выявлена в 53,33% случаях и в группе с распространенным процессом - 88,88% случаях (рис. 2). Наряду с р53 наиболее последовательно в канцерогенезе солидных опухолей изучается роль гена bcl-2. Известно, что продукт этого гена, белок Bcl-2, ингибирует р53-зависимый и независимый апоптозные метаболические пути. В свою очередь, белок р53 снижает активность bcl-2, что, возможно, запускает апоптоз в клетках с поврежденной ДНК. Показано, что bcl-2 подавляет Fas-зависимый апоптоз [2]. Изучен механизм, благодаря которому bcl-2 реализует свою функцию при апоптозе [12,11]. Данные относительно уровня экспрессии белка bcl-2 и возможностей использования его в качестве прогностического фактора у больных с солидными опухолями достаточно противоречивы [1].
Рис. 1. Экспрессия р53 в эпителии и строме шейки матки в динамике опухолевой прогрессии
Рис. 2. Экспрессия р53+ в клетках рака шейки матки (микрофото, увел. 600)
Результаты проведенного нами исследования по оценке экспрессии bcl-2 атипическими эпителиальными клетками представлены на рис. 3, 4.
Рис. 3. Экспрессия Bcl-2 в эпителии и строме шейки матки в динамике опухолевой прогрессии
Рис. 4. Содержание Bcl-2+ в клетках рака шейки матки (микрофото, увел.х600)
Показано резкое и значимое усиление экспрессии при местноограниченном процессе по сравнению с начальным процессом (66,67 против 33,33%) и последующее снижение экспрессии при распространенном процессе до 33,33%. Динамика экспрессии Bcl-2 в строме аналогичная (см. рис. 3).
Анализ ИГХ исследований показал, что положительная реакция с антителами к ЭФР была выявлена в группе пациентов на начальной стадии процесса в эпителиальных клетках только у одной больной (6,6%) (рис. 5).
Рис. 5. Экспрессия ЭФР в эпителии и строме шейки матки в динамике опухолевой прогрессии
В строме положительная реакция на ЭФР была выявлена в 5 случаях (3,3%). У пациентов с местно-распространенным процессом положительная реакция на ЭФР не была выявлена и в строме была выявлена в двух (33,3%) случаях (рис. 6). Также не была выявлена положительная реакция с антителами к ЭФР в эпителиальных клетках у пациенток с распространенным процессом. В строме у пациенток этой группы положительная реакция была выявлена в трех (13,3%) случаях. Согласно данным литературы экспрессия ЭФР наблюдается примерно в 40% злокачественных опухолей ЖКТ, легкого, яичников, матки [10]. При этом можно считать достоверным, что гиперэкспрессия ЭФР играет важную роль в канцерогенезе, является маркером, характеризующим биологическое поведение опухоли и позволяющим индивидуализировать подходы при назначении терапии.
Рис. 6. Экспрессия ЭФР в раковых клетках шейки матки (микрофото, увел.600)
Вывод
Таким образом, определение уровня экспрессии таких биомолекулярных маркеров,. как р53, Bcl-2 и ЭФР, имеет несомненное практическое значение для оценки биологического портрета опухоли при РШМ в динамике опухолевой прогрессии. В то же время сверхэкспрессия ЭФР у больных РШМ встречается редко, что, возможно, свидетельствует о его незначительной роли в патогенезе РШМ.
Работа поддержана гос. заданием Минобрнауки России и грантом Президента РФ.
Рецензенты:
-
Родионов В.В., д.м.н., заведующий II хирургическим отделением ГУЗ «Областной клинический онкологический диспансер», г. Ульяновск;
-
Слесарев С.М., д.б.н., профессор кафедры биологии и биоэкологии ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», г. Ульяновск.
Работа поступила в редакцию 03.07.2012.